硕士论文答辩PPT0 76 50.ppt 51页

'曲霉菌实时荧光定量PCR检测体系的建立研究生导师学院Theestablishmentofreal-timefluorescentquantitativePCRassaysforthedetectionofAspergillus 21.研究背景2.研究目的3.实验路线4.第一部分曲霉菌标准株的培养与DNA提取5.第二部分曲霉菌FQ-PCR检测体系的建立及评价6.结果与讨论7.全文结论目录 3研究背景 4研究背景曲霉菌属(aspergillus)：属丝状真菌，是一种常见的条件致病性真菌，好发于免疫低下及缺陷的人群在免疫缺陷、恶性肿瘤、器官移植患者中的感染率呈上升趋势YuY,AmJperinatol,2013MelladoE.RevlberoamMicol,2013Armstrong-JamesD.Trendsinmicrobiology,2014KauffmanCA.Fungalinfections.2013 研究背景地方性真菌1%地方性真菌3.5%1990年-1999年2000年-2008年leukemiapatients,M.D.AndersonCancercenter,CID,2010,50:405-15杨尚伦.急性淋巴细胞白血病真菌感染临床特点分析[J].实用癌症志,2014(9):1182-1184.2008年-2013年 6研究背景侵袭性曲霉菌病（InvasiveAspergillosis,IA）：是感染曲霉菌所引起的一种慢性霉菌病最常见的致病性曲霉菌：烟曲霉菌、黄曲霉菌土曲霉菌、黑曲霉菌ArvanitisM.ClinicalInfectiousDiseases,2015Kwon-ChungKJ.PLoSPathog.2013 7研究背景培养直接涂片镜检影像学GM实验组织病理FQ-PCR曲霉菌辅助检查方法直接涂片和培养阳性率低取材有创、困难真菌感染诊断的研究热点缺乏特异性，特征性表现出现晚灵敏性、特异性高，但易受影响，出现假阳性及假阴性 FQ-PCR技术在病毒感染的诊断检查技术方面已经成熟目前没有标准的用于临床的曲霉菌FQ-PCR检测试剂盒（CFDA检索）前期已成功建立了念珠菌及新型隐球菌实时荧光定量PCR检测体系8研究背景LauAMethodsMolBiol,2013AittakorpiA.Journalofclinicalmicrobiology,2012 建立曲霉菌实时荧光定量PCR检测体系，关键在于曲霉菌DNA的提取和特异性引物探针的设计研究背景 10研究背景曲霉菌DNA提取方法史俊艳.临床常见曲霉菌体外药物敏感性及分子生物学鉴定方法研究[D].中国协和医科大学,2010.Klimek-OchabM.FoliaMicrobiologica,2011 11研究背景曲霉菌DNA提取方法的选取物理方法液氮研磨法：次之，已有商品化试剂盒玻璃珠机研磨法：最佳，但耗时长超声波降解法化学方法CTAB缓冲液加微波法酶消化法：快速有效高渗震扰法Klimek-OchabM.FoliaMicrobiologica,2011RittenourWR.JournalofEnvironmentalMonitoring,2012O"ConnorL.US20110311969[P].2011 理论18SrDNA、28SrDNA、5.8SrDNA、ITS1、ITS2实际A.fumigatuseasLgene、A.flavusaflEgene、A.terreusCBMAI0193gene、A.nigeralpha-1,3-glucansynthasegene研究背景GadeL,EukaryotCell,2013OgawaM.GraefesArchClinExpOphthalmol,2012RobinsonSL.Mycologia,2012YuquanX.Applied&EnvironmentalMicrobiology,2013扩增靶序列的选取1.探针不保守2.引物Tm值不达要求 13初步设计合成的四种曲霉菌引物探针序列（每种2套）菌种引物探针序列Tm值(℃)A.fumigatus1F：CCTCCAGCCAAACCTGAACTTP：GGCACCAGAACCTCCCGCTGAAAATGR：TTCGTCATTGTTTAGAGCCACCT60.167.460.2A.fumigatus2F：AGCCTCGGGATGTGGTTCAP：CTGGACCCATGACCAATCTTCTGTGTGR：TCGTCGGTCACTTTCCTTGC61.963.362.5A.flavus1F：TGGGCTGTTTTGCTGTATGGTTP：AATTCGTCTCATCAAAGAGGCATCCTCGCR：TGCTGAAGGACTAAAAGGACAAGG62.164.660.3A.flavus2F：ATCCGTCGCCTCCCATCTTP：AGCCACTGGCAGAAGGAAGCACTTCR：CTTCTCGCTCTTCGTTCTACTCG60.667.959.0A.terreus1F：ACGCACTCTTCGTCACAACCP：GCTCGCAAGCCTCTGCTGCCTR：CCCAACATACCCTTTCCACCC61.168.459.4A.terreus2F：GGACCAAGTGTAAGTCACCCAATA61.9P：CAACCATCCCGGTCCGTTAGAGC63.4R：ACGGCAACCAACGACGAG59.1A.niger1F：GCCCAACCCTGACCCAACT65.9P：GATACGGCGGCCCTAGAGGATACT67.1R：TAGACCAGCGACCGACGAAC61.3A.niger2F：TCACCGCTGCTGTTCTTGC60.9P：CATGCCCGGTGGCTCTCCTTCC68.5R：CACTTGTCTTCGGCCTGCTT60.4研究背景 14研究目的寻找曲霉菌DNA提取方法设计特异性引物探针建立曲霉菌FQ-PCR检测体系 课题来源湖南省科技厅科技计划项目（2013FJ6028）儿童血液肿瘤疾病侵袭性真菌感染的PCR检测研究湖南省科技厅科技计划项目（2013FJ6028）儿童血液肿瘤疾病侵袭性真菌感染的PCR检测研究湖南省科技厅科技计划项目（2013FJ6028）儿童血液肿瘤疾病侵袭性真菌感染的PCR检测研究湖南省科技厅科技计划项目（2013FJ6028）儿童血液肿瘤疾病侵袭性真菌感染的PCR检测研究 16实验线路 曲霉菌标准株的接种及培养制备提取DNA的标本200mg左右的固体组织105个孢子/ml的混悬液液氮研磨法一步结合加热法下载曲霉菌特异性序列设计引物探针并Blast对比筛选引物探针建立的荧光定量PCR检测体系，并进行重复性、特异性、灵敏性评估1.分光光度计进行比较2.荧光定量PCR进行比较引物探针送上海合成 18第一部分曲霉菌标准株的培养与DNA提取方法的比较 19材料与方法 实验材料实验菌株真菌标准株：烟曲霉(CGMCC3.5305)、黄曲霉(CGMCC3.5306)、土曲霉(CGMCC3.4341)、黑曲霉(CGMCC3.4335)购买于中国通微生物菌种保藏管理中心主要试剂一步法结合加热法DNA提取试剂盒：湖南圣湘生物有限公司E.Z.N.A.TMFungalDNAMiniKit(真菌DNA提取试剂盒)：OMEGA公司20 实验方法1.SDA培养基培养曲霉菌2.制备DNA提取标本及提取DNA3.分光光度计检测两种方法的DNA浓度及OD值4.荧光定量PCR比较两种方法，观察曲线5.利用SPSS19.0统计软件分析不同方法提取DNA扩增的效果21 22实验结果与讨论 23不同曲霉菌在SDA培养基上生长形态烟曲霉菌黄曲霉菌土曲霉菌黑曲霉菌结果与讨论：1.曲霉菌的培养 24不同曲霉菌光镜下菌落形态烟曲霉菌（X100）黄曲霉菌（X100）土曲霉菌（X100）黑曲霉菌（X40）结果与讨论：1.曲霉菌的培养 25生长速度肉眼形态肉眼颜色镜下形态烟曲霉菌3-4天见色素扁平状深浅不同的绿色烧瓶状黄曲霉菌3-4天见色素褶皱呈脑回状黄绿色球型或近球型土曲霉菌2-3天见色素扁平状黄白色半球形黑曲霉菌3-4天见色素褶皱呈脑回状黑色球型或近球型肉眼观察SDA培养基上四种的菌落形态及颜色结果与讨论：1.曲霉菌的培养 26结果与讨论：1.曲霉菌的培养曲霉菌培养的污染问题因空气中广泛存在各种霉菌孢子，接种时若培养基长期暴露在空气中，则容易被污染同时高浓度培养的标准株若孢子纷飞可对实验室造成灾难性的损害，所以曲霉菌的接种及标本的制备必须在至少2级生物安全柜中进行，于接种前紫外灯照射半小时，接种后至少照射2小时 27表：分光光度计测量液氮研磨法提取的DNA纯度和OD值菌种浓度(ng/ul)OD260/OD280A.fumigatus2391.84A.flavus3121.91A.terreus2781.73A.niger2961.80均值281.11.82参考值200-5001.7-1.9注：一步结合加热法提取的DNA量少，低于分光光度计检测的下限，未能检测出OD值，但两者样本的基础组织量不同，不具有可比性结果与讨论：2.DNA提取方法的比较 28结果与讨论：2.DNA提取方法的比较液氮研磨法与一步结合加热法提取DNA行实时荧光定量PCR的比较液氮研磨法一步结合加热法扩增曲线均为“S”型 29结果与讨论：2.DNA提取方法的比较方法液氮研磨法一步结合加热法均值31.7332.07标准误1.931.93t值-0.124P0.903两种DNA提取方法Ct值的比较P﹥0.05，差异无统计学意义，即两种方法提取DNA进行荧光定量PCR检测无明显统计学差异 30液氮研磨法一步结合加热法来源商品化的试剂盒圣湘公司开发中的试剂盒优点提取出的DNA浓度、纯度高、完整性好操作简单、快捷缺点耗时长、操作复杂、标本要求量大且限定、易污染较液氮研磨法DNA提取的浓度、纯度低标本类型200mg固体组织标准株悬浮液PCR曲线典型“S”型“S”型临床适应标本组织病理标本肺泡灌洗液、血清等液体标本展望基本不能应用于临床有待更多的临床标本进行检测两种DNA提取方法的对比结果与讨论：DNA提取方法的比较 31第二部分曲霉菌FQ-PCR检测体系的建立及评价 32材料与方法 33实验菌株实验用真菌标准株：多种曲霉菌购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心湖南省微生物室提供多种细菌。湖南圣湘生物有限提供乙肝病毒、支原体、衣原体、巨细胞病毒、结核菌、EB病毒。主要试剂Taq酶、Tris-HClEDTA、Buffer、dNTP（0.1mol/L）、MgCl2（1mol/L）、PCR引物和探针实验材料 34实验方法1.设计引物探针2.筛选引物探针3.PCR扩增产物送检测序4.培养其他曲霉菌及收集实验室标本评估体系特异性5.检测体系重复性：采用三种不同浓度的标本，批内：每一浓度同一天重复点样20次，批间：每一浓度连续5天重复点样20次，计算Ct值变异系数（CV），若CV<5%，重复性好6.灵敏性检测：取102个孢子/ml标准菌株悬浮液按1:1、1:2、1:3的比例稀释进行FQ-PCR 35反应体系CnPCRBuffer(μl)36Mg2+(1mol/L)(μl)0.2dNTPs(0.1mol/L)(μl)0.8ForwardPrimers(pmol)10ReversePrimers(pmol)10Probes(pmol)5TaqDNAPolymerase(2U/μl)(μl)2TemplateDNA(μl)*10实时荧光定量扩增条件：94°C预变性5min后进入循环，94°C15s、57°C30s，共45个循环，在每个循环末收集荧光信号。实时荧光定量PCR反应体系（50ul）实验方法 36实验结果与讨论 37液氮研磨法提取的DNA为底物，四种曲霉菌不同引物、探针行实时荧光定量PCR扩增曲线A.fumigatus引物探针1A.fumigatus引物探针2A.flavus引物探针1A.flavus引物探针2结果与讨论：1.引物探针的筛选 38液氮研磨法提取的DNA为底物，四种曲霉菌不同引物、探针行实时荧光定量PCR扩增曲线A.terreus引物探针1A.terreus引物探针2A.niger引物探针1A.niger引物探针2结果与讨论：1.引物探针的筛选 菌种引物探针序列Tm值(℃)A.fumigatus1F：CCTCCAGCCAAACCTGAACTTP：GGCACCAGAACCTCCCGCTGAAAATGR：TTCGTCATTGTTTAGAGCCACCT60.167.460.2A.flavus1F：TGGGCTGTTTTGCTGTATGGTTP：AATTCGTCTCATCAAAGAGGCATCCTCGCR：TGCTGAAGGACTAAAAGGACAAGG62.164.660.3A.terreus2F：GGACCAAGTGTAAGTCACCCAATA61.9P：CAACCATCCCGGTCCGTTAGAGC63.4R：ACGGCAACCAACGACGAG59.1A.niger1F：GCCCAACCCTGACCCAACT65.9P：GATACGGCGGCCCTAGAGGATACT67.1R：TAGACCAGCGACCGACGAAC61.3结果与讨论：1.引物探针的筛选四种曲霉菌筛选完成的引物探针序列 40结果与讨论：2.扩增产物测序普通PCR扩增产物进行电泳分析四种曲霉菌DNA的特异性序列扩增产物电泳条带清晰、亮度高，无拖带、涂抹带现象，扩增产物长度均约为100bp左右，扩增产物完整性好 41结果与讨论：2.扩增产物测序PCR扩增产物送至上海公司测序Blast结果 42结果与讨论：3.特异性检测四种曲霉菌FQ-PCR特异性检测其他曲霉菌、真菌及细菌、人类基因均未见扩增曲线，引物探针特异性好，与其他真菌、细菌、人类基因无交叉反应。 结果与讨论：4.重复性实验四种曲霉菌批内重复性试验A.fumigatusA.flavusA.terreusA.niger 结果与讨论：4.重复性实验批内重复性试验Ct均值与标准差 结果与讨论：4.重复性实验批间重复性试验Ct均值与标准差批内、批间重复性试验CV最大值均<5%，反应体系重复性好 46结果与讨论：5.灵敏度检测四种曲霉菌FQ-PCR灵敏度检测曲线A.fumigatusA.flavusA.terreusA.niger不同真菌、每一浓度均可见扩增曲线，且每一种稀释浓度的重复样本扩增比例均大于95%，结果显示灵敏度均为35个孢子/ml 47全文结论 全文结论1.对于曲霉菌属固体组织标本，液氮研磨法提取DNA浓度、纯度高，对于曲霉菌属标准株培养的孢子冲洗标本，一步结合加热法提取曲霉菌DNA操作简单、能有效的运用于实时荧光定量PCR检测。48 全文结论2.成功筛选出烟曲霉菌、黄曲霉菌、土曲霉菌、黑曲霉菌引物探针，并建立了曲霉菌实时荧光定量PCR检测体系，其检测体系特异性、灵敏性高及重复性好。49 展望本实验已成功建立了特异性、灵敏性高、重复性好的曲霉菌实时荧光定量PCR检测体系后续实验将继续收集更多临床标本，对DNA提取方法及引物探针进行验证可能存在的问题：1.血浆、肺泡灌洗液等临床标本，可能存在影响DNA提取效果的成分2.最好探索出通用型的曲霉菌属探针，用于临床感染的筛查50 特别致谢导师湖南省人民医院儿童医学中心团队湖南省人民医院特别鸣谢湖南圣湘生物科技有限公司给与的实验支持与帮助'