植物组织培养课件PPT培养基及其配制上课讲义.ppt 34页

'植物组织培养课件PPT培养基及其配制 一、培养基的种类最早的培养基:是Sacks(1680)和Knop(1681)，根据植物从土中主要是吸收无机盐营养，设计出了由无机盐组成的Sacks和Knop溶液. 常用的培养基及特点如下：(1)MS培养基1962年，Murashige和Skoog，培养烟草细胞。特点：无机盐和离子浓度较高，为较稳定的平衡溶液；硝酸盐含量较其他培养基为高；应用广泛—基本培养基。(2)B5培养基1968年，Gamborg等，培养大豆根细胞。特点：含有较低的铵，对有些植物的生长有抑制作用；适宜于双子叶植物特别是木本植物。(3)White培养基1943年，White，培养番茄根尖。特点：无机盐数量较低，适于生根培养。（4）N6培养基1974年，朱至清等，水稻等禾谷类作物花药培养。特点：成分较简单，KNO3和（NH4）2SO4含量高。在国内已广泛应用于小麦、水稻及其他植物的花药培养和其他组织培养。(5)KM—8P培养基1974年，原生质体培养。特点：有机成分较复杂，它包括了所有的单糖和维生素，广泛用于原生质融合的培养。 二、培养基的成分水、无机盐、有机物、天然复合物、植物激素、培养体的支持材料、抗生素、活性炭等。 （一）水是植物原生质体的组成成分，也是一切代谢过程的介质和溶媒。它是生命活动过程中不可缺少的物质。配制培养基母液时要用蒸馏水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止贮藏过程发霉变质。大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。 （二）无机元素(inorganicelement)大量元素：指浓度大于0.5mmol／L的元素等。其作用是：(1)N是细胞质、细胞核、生物膜等的组成成分，是生命不可缺少的物质。供应形式：NO3—N、NH4—N。NH4—N对植物生长较为有利。供应物质：KNO3、NH4NO3、K2SO4、氨基酸等。(2)P是磷脂的主要成分。参与生物膜、核酸、ATP、ADP等的组成。供应形式：磷酸二氢根、磷酸氢根供应物质：KH2P04或NaH2P04等。在植物组织培养过程中，向培养基内添加磷，不仅增加养分、提供能量，而且也促进对N的吸收，增加蛋白质在植物体中的积累。 (3)K作用：对碳水化合物合成、转移、以及氮素代谢等有密切关系。一般为1—3mg／L为好。供应物质：KCI、KN03等盐类提供。(4)Mg、S和CaMg-是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂；S-是含S氨基酸和蛋白质的组成成分。Ca-是构成细胞壁的一种成分，Ca对细胞分裂、保护质膜不受破坏有显著作用。 微量元素指小于0.5mmol／L的元素，Fe，B，Mn，Zn、Cu，Mo，Co等。铁-是一些氧化酶、细胞色素氧化酶、过氧化氢酶等的组成成分；是叶绿素形成的必要条件。对胚的形成、芽的分化和幼苗转绿有促进作用。供应物：鳌合铁（FeSO4·7H20+Na2—EDTA）在制做培养基时不用Fe2（SO4）3，和FeCl3(因其在pH值5．2以上，易形成Fe(OH)3的不溶性沉淀)。B，Mn，Zn，Cu，Mo，Co等：也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常现象。 （三）有机化合物(organiccompound)培养基中若只含有大量元素与微量元素，常称为基本培养基（basicmedium)。为不同的培养目的往往要加入一些有机物以利于快速生长。常加入的有机成分主要有以下几类： 碳水化合物最常用的碳源是蔗糖，葡萄糖和果糖也是较好的碳源。麦芽糖、半乳糖、甘露糖和乳糖在组织培养中也有应用。——蔗糖使用浓度在2%—5%，常用3%，即配制一升培养基称取30g蔗糖。——高压灭菌时，一部分糖会发生分解，制定配方时要给予考虑。在大规模生产时，可用食用的绵白糖代替。 维生素(vitamin)以各种辅酶的形式参与多种代谢活动，对生长、分化等有很好的促进作用。VBl(盐酸硫胺素)：对愈伤组织的产生和生活力有重要作用。VB6(盐酸吡哆醇)：能促进根的生长。Vpp(烟酸)：与植物代谢和胚的发育有一定关系。Vc（抗坏血酸）：有防止组织变褐的作用。(酚类物质-醌)一般用量：0．1—1．0mg／L。有时用量较高。有时还使用生物素、叶酸、VB12等。 肌醇(myo—inosltol)又叫环己六醇作用：能促进愈伤组织的生长以及胚状体和芽的形成。对组织和细胞的繁殖、分化有促进作用。对细胞壁的形成也有作用。使用浓度：一般为lOOmg／L， 氨基酸(alminoacide)是很好的有机氮源，可直接被细胞吸收利用。常用的氨基酸：甘氨酸，其他的如精氨酸、谷氨酸，谷酰胺、天冬氨酸、天冬酰胺、丙氨酸等也常用。水解乳蛋白或水解酪蛋白：它们是牛乳用酶法等加工的水解产物，是含有约20种氨基酸的混合物，用量在10-1000mg／L之间。由于它们营养丰富，极易引起污染。如在培养中无特别需要，以不用为宜。 （四）天然复合物其成分比较复杂，大多含氨基酸、激素、酶等一些复杂化合物。它对细胞和组织的增殖与分化有明显的促进作用，但对器官的分化作用不明显。它的成分大多不清楚，所以一般应尽量避免使用。 1)椰乳是椰子的液体胚乳。它是使用最多、效果最大的一种天然复合物。一般使用浓度在10%—20%，与其果实成熟度及产地关系也很大。它在愈伤组织和细胞培养中有促进作用。在马铃薯茎尖分生组织和草莓微茎尖培养中起明显的促进作用，但茎尖组织的大小若超过1nun时，椰乳就不发生作用。2)香蕉用量为150-200ml／L。用黄熟的小香蕉，加入培养基后变为紫色。对pH值的缓冲作用大。主要在兰花的组织培养中应用，对发育有促进作用。3)马铃薯(potato)去掉皮和芽后，加水煮30min，再经过过滤，取其滤液使用。用量为150—200g／L。对pH值缓冲作用也大。添加后可得到健壮的植株。4)水解酪蛋白为蛋白质的水解物，主要成分为氨基酸，使用浓度为100—200mg／L。受酸和酶的作用易分解，使用时要注意。5)其他酵母提取液(YE)(0.01%-0.05%)，主要成分为氨基酸和维生素类；麦芽提取液(0.01%～0.5%)、苹果和番茄的果汁、黄瓜的果实、未熟玉米的胚乳等。遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。 （五）植物生长调节物(hormone)▲植物激素是植物新陈代谢中产生的天然化合物，它能以极微小的量影响到植物的细胞分化、分裂、发育，影响到植物的形态建成、开花、结实、成熟、脱落、衰老和休眠以及萌发等许许多多的生理生化活动。▲植物激素的种类：促进生长：生长素、细胞分裂素、赤霉素抑制生长：脱落酸、乙烯▲在培养基的各成分中，植物生长调节物是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。 1.生长素类(auxin)主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。☆IAA(indoaceticacid吲哚乙酸)是天然存在的生长素，亦可人工合成，其活力较低，是生长素中活力最弱的激素，对器官形成的副作用小、，高温高压易被破坏，也易被细胞中的1AA分解酶降解，受光也易分解。☆NAA(naphthaleneaceticacid萘乙酸)在组织培养中的起动能力要比IAA高出3-4倍，且由于可大批量人工合成，耐高温高压，不易被分解破坏，所以应用较普遍。NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。☆IBA(indolebutyriacid吲哚丁酸)是促进发根能力较强的生长调节物质。☆2，4—D(2，4—二氯苯氧乙酸)起动能力比IAA高10倍，特别在促进愈伤组织的形成上活力最高，但它强烈抑制芽的形成，影响器官的发育。适宜的用量范围较狭窄，过量常有毒效应。 2.细胞分裂素类(cytokinin)这类激素是腺嘌吟的衍生物，包括6—BA(6—苄基腺嘌呤)、Kt(kinetin激动素)、Zt(zeatin玉米素)等。其中Zt活性最强，但非常昂贵，常用的是6—BA。作用：①诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。②促进细胞分裂与扩大。③抑制根的分化。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化和茎、苗的增殖，而在生根培养时使用较少或用量较低。 3.GA(gibberellicacid赤霉素)作用：▲促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株；▲赤霉素和生长素协同作用，对形成层的分化有影响。（当生长素／赤霉素比值高时有利于木质部分化，比值低时有利于韧皮部分化）▲赤霉素还用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。 激素配比模式生长素与细胞分裂素的比例决定着发育的方向:高有利于根的形成和愈伤组织的形成生长素/细胞分裂素适中有利于根芽的分化、愈伤组织低有利于芽的形成生长调节物质的使用甚微，一般用mg／L表示浓度。在组织培养中生长调节物质的使用浓度，因植物的种类、部位、时期、内源激素等的不同而异。一般生长素浓度的使用为0.05-5mg／L，细胞分裂素0.05—10mg／L。 GrowthmediumisoptimisedforregenerationofplantletsNosucrose(0%)Sucrosereducedto1%Sucroseincreasedto5%Theexplantiscompletelycoveredwithgreenshoots,androotsaredevelopingonthelowersurfaceVeryfewshootshavedevelopedontheexplant.Norootsandnocallus.Shootsdevelopedonedgesofuppersurface,andsomerootdevelopmenthasoccuredShootshavedevelopedoverthesurfaceoftheexplant,alongwithrootsfromthelowersurface.TheresultiscomparablewiththecontrolmediumtissuecultureintheAfricanViolet NoBABAreducedto0.1mg.l-1NoNAAPoorshootdevelopmentandnoroots.ExtensivecallusgenerationPoorshootdevelopmentandnorootsNAAreducedto0.1mg.l-1Morebalanceddevelopmentofrootsandshoots.However,undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplantProfusedevelopmentofrootsandareducednumberofshoots.Undifferentiatedcallusisdevelopingattheedgesoftheexplant NAAincreasedto5.0mg.l-1Profusedevelopmentofrootsovertheexplantupperandlowersurface,andfewshoots.SomecallusNoMSsaltsNosignofregenerationfromexplantatall.MSsaltsreducedto0.47g.l-1SomerootgrowthbutreduceddevelopmentofshootsMSsaltsincreasedto9.52g.l-1Shootsdevelopedonuppersurfaceofexplant.Norootsorcallus. （六）培养材料的支持物琼脂(agar)：是最好的固化剂。是一种由海藻中提取的高分子碳水化合物，本身并不提供任何营养。琼脂能溶解在热水(90℃)中，成为溶胶，冷却至40℃即凝固为固体状凝胶。琼脂的用量:在6—10g／L之间，若浓度太高，培养基就会变得很硬，营养物质难以扩散到培养的组织中去。若浓度过低，凝固性不好。一般琼脂以颜色浅、透明度好、洁净的为上品。琼脂的凝固能力:与高压灭菌时的温度、时间、pH值等因素有关，长时间的高温会使凝固能力下降，过酸过碱加之高温会使琼脂发生水解，丧失凝固能力。时间过久，琼脂变褐，也会逐渐丧失凝固能力。 固体培养基的优点：操作简便，易于解决通气问题，便于经常观察研究固体培养基的缺点：培养物与培养基的接触(即吸收)面积小，各种养分在琼脂中扩散较慢，影响养分的充分利用，同时培养物排出的一些代谢废物，聚集在吸收表面，对组织产生毒害作用。其他：有玻璃纤维、滤纸桥、海绵、脱脂棉、卡拉胶等，总的要求是排出的有害物质对培养材料没有影响或影响较小。 （七）抗生物质(antibiotic)抗生物质：青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5—20mg/L之间。----对于刚感染的组织材料，可向培养基中注入5%—10%的抗菌素。抗生素各有其抑菌谱，要加以选择试用，也可两种抗生素混用。注意:----抗生素对植物组织的生长也有抑制作用;----某些植物适宜用青霉素，而另一些植物却不大适应;----在工作中不能以为有了抗菌素，而放松灭菌措施----在停止抗生素使用后，往往污染率显著上升，这可能是原来受抑制的菌类又滋生起来造成。 （八）活性炭(activecarbon)活性炭——木炭粉碎经加工形成的粉沫结构，它结构疏松，孔隙大，吸水力强，有很强的吸附作用。使用浓度：0.5—l0g／L。 活性炭的应用1、具抑褐作用：可以吸附外植体产生的致死性褐化物，其效力优于Vc和半胱氨酸；在新梢增殖阶段，活性炭可明显促进新梢的形成和伸长，一般使用浓度为0.1%—0.2%，不能超过0.2%。2、活性炭对生根培养有明显的促进作用：其机理一般认为与活性炭减弱光照有关，可能是由于根顶端产生促进根生长的IAA，但IAA易受可见光的光氧化而破坏，因此活性炭的主要作用就在于通过减弱光照保护了IAA，从而间接促进了根的生长，由于根的生长加快，吸收能力增强，反过来又促进茎、叶的生长。3、可降低玻璃化苗的产生频率：在培养基中加入0.3%活性炭，对防止产生玻璃苗有良好作用。 三培养基的制备（一）、母液(stocksolution)（贮备液）的配制和保存——欲配制液的浓缩液。一般母液配成比所需浓度高10-100倍。作用：保证各物质成分的准确性及配制时的快速移取；便于低温保藏。注意：1.离子之间发生沉淀，如Ca2+和S042+，Ca2+、Mg2+和PO43-一起溶解后，会产生沉淀，要充分溶解再放入母液中。2.要用蒸馏水或重蒸馏水。3.药品应选取等级较高的化学纯或分析纯。4.母液配制时可分别配成大量元素、微量元素、铁盐、有机物和激素类等。其中维生素、氨基酸类可以分别配制，也可以混在一起。5.母液配好后放人冰箱内低温保存，用时再按比例稀释。 母液的配制方法：将几类营养成分按配方中的用量扩大一定倍数（a）称量，分别溶解后，混合在一起，定容到一定体积配成混合母液，浓度可用axmg/L表示，即配制一升培养基吸取该母液1000/aml.生长素：用少量95%酒精助溶。配成1mg／ml。2，4—D：用0.1mol／L的NaOH或KOH助溶，温水定容。细胞分裂素类：少量1N盐酸溶解后，加入温水冷却后定容。铁盐（MS为例）：在装有400ml蒸馏水的烧杯中加入2粒苛性钠，溶解后加入3.73gEDTA-Na2，加热使其全部溶解，然后边搅拌边慢慢加入2.78gFeSO4.7H2O直至全部溶解，冷却后定容至500ml，置于冰箱中备用。（200a） (二)培养基的配制及其灭菌培养基的配制方法1.将母液按顺序排列、检查是否失效（沉淀或变色2.在有适量蒸馏水(3/4)的容器中加入适量琼脂和糖加热溶化3.依次吸取各种母液和生长调节物质移到容器中4.用蒸馏水定容5.调节pH值(用0.1M的NaOH或HCl调节)6.进行分装（20-30ml/瓶） 培养基的灭菌方法：详见第四章（操作技术） 思考题1．MS固体培养基的主要成分包括哪些？2．根据已知条件，计算配制650ml培养基各母液的用量，并写出在实验室配制该培养基的各操作步骤。已知：⑴.培养基配方：MS+6-BA1.5mg/L+2,4-D0.5mg/L+0.4%琼脂粉。⑵.实验室有如下母液:10倍的大量元素；50倍的微量元素；100倍的铁盐；100倍的有机物；1mg/ml的6-BA；1mg/ml的2,4-D。⑶.若干琼脂粉和蔗糖。3．固体培养与液体培养各有何优缺点？4．配置培养基时，常用的植物生长调节剂都是哪些？各有何作用。5．琼脂有什么作用？1例L培养基通常加多少g琼脂？6．常用培养基有哪些？它们各有何特点？举例：非洲紫罗兰嫩叶离体培养的过程。 此课件下载可自行编辑修改，仅供参考！感谢您的支持，我们努力做得更好！谢谢'