最新实验一 动物肝脏组织中基因组DNA提取和鉴定课件PPT.ppt 28页

'实验一动物肝脏组织中基因组DNA提取和鉴定 核酸的分类DNA(脱氧核糖核酸)主要存在于细胞核的染色体中。核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA（cpDNA），质粒DNA。RNA（核糖核酸）存在于细胞质中，如mRNA,rRNA,tRNA等。除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬菌体，其或只含DNA，或只含有RNA。2 核酸的理化性质在细胞内通常与蛋白质结合，以复合物形式存在。溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。在酸性溶液中容易降解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。在强大离心力的作用下，可以从溶液中沉降下来。3 学习并掌握用高盐法从动物肝脏组织中的提取基因组DNA方法及其原理。一、实验目的7 二、实验原理核酸在真核细胞中都是以与蛋白质结合的状态存在，用DNP和RNP表示。DNA-Pro（DNP）(存在于细胞核)RNA-Pro(RNP)(存在于核仁及细胞质)溶于高盐溶液（1mol/L）,微溶于低盐溶液（0.14mol/L）溶于低盐溶液（0.14mol/L）微溶于高盐溶液（1mol/L）8 三、仪器和试剂1、仪器：低速离心机、落地式高速冷冻离心机、摇床、稳压电源、电泳槽、凝胶成像系统。2、试剂：0.14mol/LNaCl－0.15mol/LEDTA(pH=8.0)；2.5mol/LNaCl；25%SDS；氯仿/异戊醇=24:1（V/V）；95%乙醇；1×TAE；琼脂糖；上样缓冲液。9 四、实验步骤1、DNA的提取（1）称取5g鸡肝，置于预冷的研钵中，在冰浴中剪碎，加入10mL预冷的0.14mol/LNaCl-0.14mol/LEDTA溶液，研磨成匀浆液。（2）将匀浆液加入到15mL刻度离心管中，2000r/min离心10min，弃去上清液。（3）将沉淀转移至50mL离心管中，加入10mL预冷的0.14mol/LNaCl-0.14mol/LEDTA溶液，充分摇匀后，于4℃2000r/min离心10min，弃去上清液。10 四、实验步骤1、DNA的提取（4）将上述沉淀转移至100mL锥形瓶中，加入10mL预冷的0.14mol/LNaCl-0.14mol/LEDTA溶液，缓慢搅拌，同时加入750uL25%SDS溶液，用封口膜封口，置于摇床中，30℃150r/min震荡30min。（5）加入7mL2.5mol/LNaCl，用封口膜封口，置于摇床中，30℃150r/min震荡10min。。（6）再加入17mL氯仿:异戊醇溶液，用封口膜封口，置于摇床中，30℃150r/min震荡20min。。11 四、实验步骤1、DNA的提取（7）将混合液转移至50mL刻度离心管中，3500r/min离心10min，取上清至一个新的50mL刻度离心管。（8）加入20mL95%乙醇溶液，上下颠倒混匀后，出现丝状物，用枪头挑取丝状物，或者3500r/min离心5min。（9）弃去上清液（注意：缓慢倒去上清液），沉淀物质即为DNA，空气干燥后即可加入适量的TE缓冲液。12 四、实验步骤2、DNA电泳检测（1）1%琼脂糖凝胶：称取0.3g琼脂糖，加入30mL1×TAE缓冲液，在微波炉中加热，反复加热、振荡2-3次，使琼脂糖充分融化。待凝胶冷却至60℃左右，倒入插入梳子的凝胶板中（避免产生气泡），让凝胶自然凝固。（2）待凝胶凝固后，小心拔出梳子，避免前后左右摇晃，以免破坏胶面及加样孔，小心将凝胶和胶床放入电泳槽中，加样孔靠近阴极的一端。（3）上样电泳：将适量DNA样品溶液和上样缓冲液混匀后，上样，100V电泳检查，根据指示剂迁移的位置，13 四、实验步骤2、DNA电泳检测（3）上样电泳：将适量DNA样品溶液和上样缓冲液混匀后，上样，60V稳压电泳检查，根据指示剂迁移的位置，判断是否中止电泳。切断电源后，再取出凝胶。（4）照胶、拍照：将凝胶泡在EB溶液（注意：EB溶液为剧毒物，需带上一次性手套拿取凝胶）中10min左右，进入暗室，使用凝胶成像系统照胶并拍照。14 匀浆（破碎细胞）要充分，需剪成小块。变性蛋白质层易散，吸取上清液时应仔细，不要将蛋白质及下层的氯仿吸入。注意事项15 电力电缆绝缘及护套厚度尺寸控制要求技术部2017.7.15 主要内容1、编制依据2、一些基本概念3、标准要求及工艺控制要求4、讨论 编制依据1、GB/T12706-20082、GB/T31480-2015 一些基本概念1、标称厚度标准中规定的标称截面积对应的绝缘层或护套层厚度2、平均厚度在电缆绝缘层或护套层断面GB/T2951.11标准规定方法测量六个点数值取其平均值即为平均厚度（图示）。一般标准规定绝缘层平均厚度不小于标称值 一些基本概念3、最薄点绝缘层或护套层断面按GB/T2951.11方法测量的最小数值即为最薄点。一般规定最薄点不小于标称值90%-0.1mm 电力电缆1、执行标准GB/T12706.1-2008、GB/T12706.2-2008GB/T12706.3-2008GB/T31840.1-2015GB/T31840.2-2015GB/T31840.3-2015 电力电缆2、绝缘厚度标准号GB/T12706.1-2008、GB/T31840.1-2015绝缘工序考核指标标准考核指标企业内控要求备注标称值最薄点平均厚度范围最薄点平均厚度不小于标称值最薄点不小于标称值90%-0.1mm平均厚度不小于标称值标称厚度≤1.0mm时，平均厚度按标称值1.1倍控制，标称厚度＞1.0时，平均厚度按标称值1.08倍控制最薄点不小于标称值90%客户有要求时按客户要求生产 电力电缆2、绝缘厚度标准号GB/T12706.2-2008、GB/T31840.2-2015、GB/T12706.2-2008、GB/T31840.2-2015绝缘工序考核指标标准考核指标企业内控要求备注标称值偏心度最薄点平均厚度范围偏心度最薄点不考核平均厚度不大于15%最薄点不小于标称值90%-0.1mm平均厚度不小于标称厚度90%，最大平均厚度≤标称值不大于10%最薄点不小于标称值90%-0.1mm客户有要求时按客户要求生产 电力电缆3、内外屏蔽厚度标准号GB/T12706.2-2008、GB/T31840.2-2015、GB/T12706.2-2008、GB/T31840.2-2015内外屏工序考核指标标准考核指标企业内控要求备注标称值最薄点平均厚度最薄点标准无指标要求不考核不超出工艺文件给定值最薄点不小于工艺规定90%-0.1mm客户有要求时按客户要求生产 电力电缆4、非铠装电缆护套厚度标准号GB/T12706-2008、GB/T31840-2015护套工序考核指标非铠装电缆标准考核指标企业内控要求备注标称值最薄点平均厚度最薄点标称厚度不作考核最薄点不小于标称值85%-0.1mm最小平均厚度不小于标称值85%，最大平均厚度不超过标称值最薄点不小于标称值85%-0.1客户或技术协议有要求时按客户要求生产 电力电缆5、铠装电缆护套厚度标准号GB/T12706-2008、GB/T31840-2015护套工序考核指标非铠装电缆标准考核指标企业内控要求备注标称值最薄点平均厚度最薄点标称厚度不作考核最薄点不小于标称值80%-0.2mm最小平均厚度不小于标称值80%，最大平均厚度不超过标称值最薄点不小于标称值80%客户或技术协议有要求时按客户要求生产说明：针对铠装型电缆，特别是钢带铠装型电缆，铠装质量好坏对电缆外观及外护套连续性影响很大，从确保产品质量前提下，企业内控要求护套平均厚度为85%-90%标称值。最薄点不小于标称值80% 讨论 结束谢谢大家！'