答辩PPT(铁皮石斛多糖) 27页

'组培铁皮石斛多糖的提取及其抗氧化性研究(1)姓名：董燕平学号：20090453012专业：食品科学与工程学校：西南林业大学1 目录组培铁皮石斛多糖简介及国内外研究现状试验目的和意义试验方法和内容试验结果试验结论结果讨论致谢2 1.组培铁皮石斛多糖简介及国内外研究现状1.1组培铁皮石斛多糖简介铁皮石斛（D.candidumWall.exLindl.）是兰科石斛属多年生附生草本植物，生于海拔达1600米的山地半阴湿的岩石上，喜温暖湿润气候和半阴半阳的环境，种子极小、无胚乳，在自然条件下，需与某些真菌共生才能萌发,故很难生产足够的实生苗用于栽培;而传统的分株、扦插等方式的繁殖率极低，加上人为的过度采挖和破坏生境，其资源已濒临灭绝，是被国家列为重点保护的药用植物之一。铁皮石斛多糖系从铁皮石斛植株里提取出的多糖类物质，经研究发现，多糖是石斛属植物的主要活性成分，在抗衰老、抗肿瘤、降低血糖等方面有很好的作用，在治疗胃肠道疾病、白内障、关节炎、血栓闭塞性脉管炎及慢性咽炎等疾病有很好的疗效。3 1.2铁皮石斛国内外研究现状随着我国经济的快速发展，人们生活水平的不断提高，人们对健康和精神生活的需求和品位也日益提高，越来越多的人们认识到要用本身健康的东西来健康自己，铁皮石斛是一味功效显著的珍稀药材，具有增强免疫力、消除肿瘤、抑制癌症、润肺清咽等药用价值和保健作用，在国际国内应用十分广泛。铁皮石斛成品目前主要加工成以下三种：（1）铁皮枫斗。通过改进传统的做法，使之从外观、质量等更符合现代消费者的习惯。（2）研磨成粉末，做成胶囊，以盒装保健食品的方式销售。这个过程并不涉及到药品加工，而申请食品保健还是很容易的。中科院植物所都有这样的技术，且很成熟，只要买批号后委托加工就可以做出成品。这个保健品服用后效果表现为：睡眠安稳绵长，无夜梦。白天精神饱满，无疲态。胃口变好，无便秘。情绪安定，不易急躁和动怒。4 （3）购买已有技术，做成中成药。小规模临床试验证明，在化疗及治疗心血管疾病方面，铁皮石斛中成药辅助疗效十分显著。以片剂口服方式，可部分替代扩张血管的西药烟酸注射液。随着功能开发和应用技术的不断发展，需求量在不断上升，目前是国内近百种药品和保健品的必需原料，全国涉及用到石斛类的制药厂和保健品加工企业有100多家。铁皮石斛主要的消费市场在我国的浙江和上海一带，另外就是港澳和东南亚地区，北京、广州、成都等地近几年市场发展较快，从我国石斛联盟发布的市场信息来看，铁皮石斛的市场和销售都在快速发展。从相关信息来看，目前世界中草药市场销售额为160亿美元，而且每年正以20~30％的速度增长，而我国的中草药产业占整个医药市场的40％左右，近五年来以年平均20％的高速度递增，铁皮石斛所占中草药产业比例越来越高。5 2.试验目的和意义2.1试验目的：铁皮石斛多糖的提取分离工艺已较为成熟，但石斛的品种繁多，应开展对其他种的石斛多糖结构的提取分离研究。本文通过以组培铁皮石斛为材料，以组培铁皮石斛提取出的多糖为主要研究对象，对照组培铁皮石斛苗和维生素C进行总还原能力、清除羟基自由基、清除超氧阴离子和清除DPPH(1，1-二苯基-2-苦基苯肼自由基)能力进行测定。通过此试验拟阐提取出的铁皮石斛多糖的抗氧化功能特性。6 2.2试验意义：自由基（freeradical）是一类含有未配对电子的基团、分子或原子，主要包括超氧阴离子、羟基自由基等，是人体内的代谢产物，在正常情况下处于动态平衡，且浓度很低。当这一平衡被打破，就会对机体造成损害引发一系列疾病。本试验尝试性的以组培铁皮石斛为对象，研究组培铁皮石斛多糖、维生素C和组培铁皮石斛苗清除自由基的能力，为组培铁皮石斛多糖抗氧化性的研究提供基础数据以及组培铁皮石斛多糖的综合开发利用奠定理论基础。7 3.试验方法和内容3.1组培铁皮石斛多糖的提取3.1.1组培铁皮石斛多糖提取工艺流程组培铁皮石斛水回流提取浓缩脱脂脱蛋白脱色干燥组培铁皮石斛多糖8破碎90℃，1h，料水比1:2060℃，0.75Kpa1h氯仿，正丁醇活性炭60℃ 3.1.2操作要点(1)破碎：组培石斛苗要充分的研磨破碎，有利于多糖的溶解分离。(2)提取：破碎的石斛组织于90℃、料水比1:20的条件下回流提取1小时，重复三次，合并提取液。(3)脱脂：浓缩液中加入100mL石油醚水浴回流至沸腾，抽真空过滤。(4)脱蛋白：以50mL多糖浓缩液，15mL氯仿，5mL正丁醇为标准比例混合振荡，不加热，离心机离心至离液面交界处无白色混悬物，也就是蛋白质介于提取液与试剂交界处即可，并分别提取。9 (5)干燥：脱色后的多糖液于烘箱中用60℃热风干燥至恒重，保存备用。3.2组培铁皮石斛多糖含量的测定试验采用蒽酮硫酸法测定组培铁皮石斛多糖含量。3.2.1葡萄糖标准曲线的绘制精密称取经105℃干燥恒重的标准葡萄糖0.05g（精确到0.0001g），用温蒸馏水溶解，并定容至1000mL。此溶液质量浓度为50μg·mL-1。分别取上述葡萄糖溶液0mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL到25mL具塞试管中，用蒸馏水补足到2mL；在冰水浴中加入4mL的2g/mL的蒽酮-硫酸溶液，摇匀，置于沸水中加热煮沸5min，取出后用流动水冷却至室温，以零管为空白，于625nm处测定吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，对应吸光值为纵坐标建立标准曲线，如下图所示。10 3.2.2组培铁皮石斛多糖含量的测定分别取组培铁皮石斛多糖储备液(50μg·mL-1)和组培铁皮石斛苗储备液(50μg·mL-1)1.6mL到25mL具塞试管中，用蒸馏水补足到2mL；在冰水浴中加入4mL的2g/mL的蒽酮-硫酸溶液，摇匀，置于沸水中加热煮沸5min，取出后用流动水冷却至室温，以葡萄糖样品中零管为空白，于625nm处测定吸光度。由标准曲线求得对应的多糖浓度，以葡萄糖计。11 3.3FRAP法测定组培铁皮石斛的总抗氧化能力3.3.1硫酸亚铁标准曲线的绘制取不同体积5～140μL的1mmol/LFeSO4溶液，用蒸馏水补足至2mL，再加入配制好的FRAP工作液3mL，混匀后于37℃反应30min，在593nm下测定样品液的吸光度值，确定还原力标准曲线。以吸光度（Y）对葡萄糖质量浓度（X）回归，得到回归方程y=0.0516x-0.0041，所得葡萄糖标准曲线如下图1所示。12 3.3.2组培铁皮石斛多糖总抗氧化能力的测定分别精密移取不同样品质量50～300μg的3种待测样品加入到有刻度试管中，加蒸馏水至2mL，再加入FRAP工作液3mL，混匀后于37℃反应30min，取出后立即在593nm处测定吸光度。以不加样品组为参照，测定样品吸光度值，每个样品平行测3次，取平均值。根据还原力标准曲线，计算相同吸光度值的FeSO4当量浓度，记为FRAP值。3.4组培铁皮石斛多糖清除羟基自由基的能力根据Fenton反应的方法，建立·OH自由基产生体系模型。在刻度试管中加入5mL的蒸馏水,30μL的0.02mol/L的FeSO4,100μL0.01mol/L水杨酸,最后加入25μL0.02mol/LH2O2启动反应,放置37℃水浴保温反应30min,之后立即在510nm处测定吸光度，作为空白吸光度值。同上，在刻度试管中分别加入不同系列5～60μg的样品后，再加入25μL0.02mol/LH2O2启动反应，水浴恒温30min,之后测定吸光度值作为加样品后吸光度值。清除率=[(A1-A0)/A0]×100%①式中:A1为加入待测物后的吸光值;A0为空白对照的吸光值。13 3.5组培铁皮石斛多糖抑制超氧阴离子自由基的能力试验中采用邻苯三酚自氧化—分光光度法测定抑制超氧阴离子自由基的能力。加入样品前：将pH8.2Tris-HCl缓冲液和50mmol.L-1邻苯三酚在25℃的恒温水浴锅中保温，取5mLpH8.2Tris-HCl缓冲液，加30μL50mmol/L邻苯三酚，摇匀，在325nm下立即测定。以pH8.2的Tris-HCl缓冲液为空白，每隔0.5min测一次吸光值，计算出平均值A0。加入样品后：取5mLpH8.2Tris-HCl缓冲液，加待测样品5～60μg、30μL50mmol/L邻苯三酚，摇匀，立即同上测定。以pH8.2Tris-HCl缓冲液为空白，每隔0.5min测一次吸光值，计算出平均值A1。抑制率=[(A0-A1)/A0]×100%②式中：A1为加入待测物后的吸光值;A0为空白对照的吸光值。14 3.6组培铁皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力3.6.1DPPH标准曲线的绘制精密称取DPPH0.0202g，加甲醇溶解定容至50mL，作为储备液。精密移取上述储备液10mL至100mL容量瓶中，定容得40.4mg·L－1的储备液备用。分别精密移取DPPH储备液0.2mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、3.5mL、4.0mL于10mL刻度试管中，用甲醇定容至刻度，摇匀，以甲醇溶剂作参比，在515nm处测定各溶液的吸光度。以DPPH的质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线。配制DPPH标准溶液系列，绘制出DPPH标准曲线见图6。标准曲线线性回归方程为y=0.0208x+0.0009，在DPPH质量浓度为2～16mg·L－1线性关系良好。15 3.6.2组培铁皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力分别在1.0mLDPPH储备液中加入不同质量(200～800μg)样品待测物，用甲醇稀释至总体积为3.00mL，混匀放置40min后，用1cm比色皿于515nm处测定吸光度，根据DPPH标准曲线回归方程计算DPPH质量浓度，按下列公式计算DPPH清除率(Y)。Y=(1-Ct/C0)×100%③式中:C0为反应体系中DPPH的起始质量浓度(mg·L－1);Ct为40min后反应体系中DPPH的质量浓度(mg·L－1)。16 4试验结果4.1组培铁皮石斛多糖提取结果：组培铁皮石斛苗在捣碎情况下于90℃、料水比1:20、1小时条件下浸提，重复操作三次，最后得组培铁皮石斛多糖得率为4.25％。4.2多糖含量测定结果：将组培铁皮石斛多糖和组培铁皮石斛苗用蒽酮-硫酸法测定多糖含量，组培铁皮石斛多糖和组培铁皮石斛苗中多糖的纯度分别是：73.15％，10.51％。由此可见，组培铁皮石斛多糖中可被检测到的多糖明显超过组培铁皮石斛苗。17 4.3FRAP法测定组培铁皮石斛的总抗氧化能力结果：由下图可知，当样品加入量在50～300μg范围时，随着组培铁皮石斛多糖、组培铁皮石斛苗及维生素C加入量的增加，其总抗氧化的能力也随之增强。组培铁皮石斛苗的抗氧化能力最弱，组培石斛多糖抗氧化能力相对较强，而维生素C的总抗氧化能力优于组培铁皮石斛苗。总体说来组培铁皮石斛多糖的总抗氧化能力明显比组培铁皮石斛苗强得多。18 4.4组培铁皮石斛多糖清除羟基自由基的能力测定结果：依据Fenton反应体系建立的清除羟基自由基能力，其结果如下图所示。由图可知，组培铁皮石斛多糖对羟基自由基清除能力高于其余样品，维生素C对羟基自由基清除能力相对较低，而组培铁皮石斛苗对羟基自由基清除能力最低。由此可知，组培铁皮石斛多糖对羟基自由基清除能力较高，而组培铁皮石斛苗对羟基自由基清除能力相对较弱。19 4.5组培铁皮石斛多糖抑制超氧阴离子自由基的能力测定结果：不同样品抑制超氧阴离子能力如图所示。由图可知，三种不同物质都具有一定的抑制超氧阴离子自由基的能力。随着样品含量的增加，样品抑制超氧阴离子自由基的能力不断增强。组培铁皮石斛苗抑制超氧阴离子自由基的能力相对较弱，当样品加量为10μg时，对超氧阴离子自由基的抑制率仅为3.48%，加样量增大到60μg时，抑制率也仅为23.47%；组培铁皮石斛多糖抑制超氧阴离子自由基能力相对较强，即当样品质量均增加到60μg时，组培铁皮石斛多糖抑制超氧阴离子自由基能力达到了47.08%，维生素C次之，抑制超氧阴离子自由基能力达到了44.19%。20 4.6组培铁皮石斛多糖清除DPPH自由基能力测定结果：根据标准曲线，得出三个样品清除DPPH自由基能力如图所示。由图可知，随着反应体系中加入组培铁皮石斛多糖、组培铁皮石斛苗及维生素C的质量愈大，其清除DPPH自由基的能力愈强。对不同样品物质所表现出来的清除DPPH自由基的能力有所不同。实验结果表明，组培铁皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力相对较强，当石斛多糖质量为700ug时，组培铁皮石斛多糖清除率达到51.91%，而其他两个样品对DPPH的清除率效果均低于组培铁皮石斛多糖。21 5.结论与讨论5.1结论：(1)通过研究表明，将组培铁皮石斛多糖和组培铁皮石斛苗用蒽酮-硫酸法测定多糖含量，石斛多糖和石斛含糖量分别是：73.15％，10.51％，组培铁皮石斛多糖中可被检测到的多糖含量明显超过了等质量的组培铁皮石斛苗；由此可见，我们将组培铁皮石斛中的多糖进行提取纯化，进而应用于食品加工中，具有重要意义。(2)三种不同样品的浓度愈大，清除羟基自由基的作用愈强，其中组培铁皮石斛多糖对羟基自由基清除能力较高，当加入样品质量达到60μg时，清除率达到91.40%，而维生素C清除能力相对较弱，组培铁皮石斛苗对羟基自由基清除能力相对最差。(3)随着样品质量的增加，抑制超氧阴离子自由基的能力增强，组培铁皮石斛多糖当其质量达到10μg以上时，抑制率达到22.12%以上，组培铁皮石斛苗抑制超氧阴离子自由基的能力也相对较弱，当其质量达到10μg时，其对超氧阴离子自由基抑制率仅为3.48%，维生素C抑制超氧阴离子自由基的能力相对好些，达到6.08%。22 (4)采用DPPH法对组培铁皮石斛苗、组培铁皮石斛多糖及维生素C进行了抗氧化活性研究，发现组培铁皮石斛苗、组培铁皮石斛多糖及维生素C在低浓度和高浓度时，均有一定的清除DPPH自由基的能力，当质量增大到400μg时组培铁皮石斛苗清除率高过维生素C，当质量增大到700μg时维生素C清除率高过组培铁皮石斛苗达45.27％；铁皮石斛多糖清除DPPH自由基的能力一直高于另外两个样品，当质量增大到700μg时清除率达到51.91%。5.2讨论：(1)在组培铁皮石斛多糖的提取过程中，恒温萃取和真空浓缩都涉及到温度的控制，在实验过程中应严格控制温度。通过查阅资料得知铁皮石斛多糖不耐高温，高温会使多糖氧化分解，从而影响试验数据结果，所以在多糖提取过程中对温度的控制要格外认真、仔细。(2)制作硫酸亚铁标准曲线和样品总还原能力测定时使用到FRAP工作液，该工作液要现用现配，否则会产生絮状物，从而影响试验效果或数据。23 (3)在测定三个样品抑制超氧阴离子时要准确把握试验过程中试剂加入的时间，保证是同一个人操作这个过程，减小因为个人操作不同带来时间把握上的差异。因为此实验过程中要求配好溶液立即测定，每个样品测定三次吸光值，且每隔30秒测一次。因此，在操作时不能等所有样品加好后统一测定，这样得出的试验数据就没有任何意义。(4)通过测定三种不同样品清除自由基能力的结果表明：不同样品物质在清除自由基时，部分低浓度清除自由基能力相对较低的样品物质，随着浓度的依次增大，其对自由基的清除率会高于原本低浓度时相对较高的样品物质。这可能是和不同样品物质在不同浓度下对自由基清除能力强弱有关。24 (5)总体说来，本试验通过对组培铁皮石斛的多糖含量进行测定以及其抗氧化性能进行尝试性的研究，对比成熟铁皮石斛其多糖含量达到4.25％，纯度达73.15％，均接近成熟铁皮石斛；在抗氧化性能方面，组培铁皮石斛多糖有良好的抗氧化作用，均优于对照品组培铁皮石斛苗和维生素C。而且组培铁皮石斛的生长周期比成熟铁皮石斛短，成熟铁皮石斛生长周期平均在16-24个月；广东惠农苗木发展有限公司研发的“惠农1、2号”营养液在母苗初期营养、培育、及壮苗嫁接、生根苗分化、种苗栽培等方面取得了革命性的突破，将组培铁皮石斛从母苗到种植种苗培育期缩短为3个月，种植种苗成活率高、药用价值和经济效益显著。相比之下，组培铁皮石斛从多糖含量和抗氧化性能以及生长周期等方面综合考虑，具有明显的开发利用优势。25 致谢本论文是在导师刘云的悉心指导下完成的，感谢刘云老师在试验中给我精心的指导和极大的帮助，使我的毕业课题能够顺利完成，试验中教会了我严谨和务实的试验风格，不仅试验过程中需要这种风格，生活中同样也需要严谨和务实；还要感谢我的指导老师阚欢教授，在课题试验过程中为我答疑解惑，给予我的鼓励和关怀，让我不断产生动力，相信这种动力对今后我的人生也是一种莫大的鼓舞；还要感谢我的搭档曾君同学，在试验过程中能充分理解我，并能及时纠正我的错误，致使我们顺利完成了试验课题；最后还要感谢班上的同学、朋友给予我的支持和帮助。谢谢，谢谢您们！26 请各位专家、同学给以批评指正，谢谢！27'