付强-金磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原免疫学检测方法的建立(西北大学硕士学位答辩PPT 32页

'金磁微粒为载体的乙肝病毒表面抗原免疫学检测方法的建立答辩人付强专业生物化学与分子生物学指导老师崔亚丽教授答辩日期2007-5-31西北大学硕士研究生论文答辩1 答辩内容•背景介绍•研究报告金磁微粒为载体的磁分离酶联免疫法检测乙肝病毒表面抗原方法的建立金磁微粒为载体的化学发光酶免疫分析法检测乙肝病毒表面抗原方法的建立•全文总结•致谢西北大学硕士研究生论文答辩2 西北大学硕士研究生论文答辩背景介绍乙型肝炎病毒概述•乙肝病毒（HBV）是一种嗜肝性DNA病毒，它是引起乙型病毒性肝炎的病原体。电镜下HBV颗粒的三种形态（摘自NEnglJMed2004,350:1118-29）HBV结构模拟图3 西北大学硕士研究生论文答辩背景介绍乙肝病毒表面抗原（HBsAg）4HBsAg种类大蛋白（LHBs）中蛋白（MHBs）主蛋白（SHBs） 西北大学硕士研究生论文答辩背景介绍5HBsAg的主要作用介导病毒进入宿主细胞诱导机体产生保护性抗体（HBsAb）早期诊断的血清学标志 西北大学硕士研究生论文答辩化学发光免疫技术背景介绍概念：集灵敏的化学发光分析和特异的抗原抗体免疫测定于一体的检测技术。特点：特异性高，敏感性高，操作简便、快速，试剂无毒，安全稳定，可自动化。目前，已有许多将化学发光免疫技术应用于临床检测的研究报道。如应用化学发光免疫分析法定量检测乙肝病毒标志物1，磁分离-酶标记-化学发光法测定促甲状腺素2等；相关的检测仪器，如：ACCESS化学发光免疫分析仪(美国BeckmanCoulter公司)81.化学发光免疫分析定量检测乙肝病毒标志物方法学研究，标记免疫分析与临床，2004,(11)3:157~159.2.磁分离-酶标记-化学发光法测定促甲状腺素的应用，国外医学临床生物化学与检验学分册，2005,(26)4:193~198. 西北大学硕士研究生论文答辩以金磁微粒为载体的HBsAg免疫学检测方法原理图背景介绍9++化学发光金磁微粒—Anti-HBsHBsAgAg-Ab复合物HRP-Ab+Luminol,H2O2,PIPAg-Ab-酶复合物｛TMB底物检测吸光度与样品浓度成正比 西北大学硕士研究生论文答辩研究目的及意义•研究目的以金磁微粒为载体，建立乙肝病毒表面抗原（HBsAg）的免疫学检测方法，并用标准HBsAg血清盘对该方法进行验证和比较，以期开发新的检测系统用于HBsAg的检测。背景介绍•研究意义HBsAg的检测可用于体检、献血员筛选、血液制品的复检、了解乙肝病毒感染者的感染状况、疗效观察及预后评估，另外还用于乙型肝炎的流行病学调查。10 实验I西北大学硕士研究生论文答辩Ⅰ.以金磁微粒为载体的磁分离酶联免疫法检测乙肝病毒表面抗原HBV表面抗体在金磁微粒表面的包被包被抗体和酶标抗体最佳工作浓度的选择温育时间的选择显色时间的选择精密度考察灵敏度考察特异性考察11 实验I西北大学硕士研究生论文答辩HBV表面抗体在金磁微粒表面的包被包被前抗体溶液在280nm处具有明显的光吸收，包被反应完毕后剩余溶液在280nm处几乎没有光吸收出现，说明抗乙肝病毒表面抗原单克隆抗体几乎全部包被在金磁微粒表面。HBsAb包被前后的紫外吸收曲线12 实验I西北大学硕士研究生论文答辩包被抗体和酶标抗体最佳工作浓度的确定不同量的包被抗原和不同稀释度的HRP-标记抗原条件下检测的阳性和阴性血清结果注：P：阳性血清；N：阴性血清酶标抗体稀释度501002003004001:600PN1.3310.0562.3210.0582.5730.0692.5820.0512.7690.0531:800PN1.140.052.1680.0582.3080.0542.5330.0522.3620.0531:1000PN0.8480.051.8390.052.0740.052.1750.052.2080.051:2000PN0.5610.051.1130.051.3300.051.4720.051.5060.511:3000PN0.2940.050.3710.050.5370.050.4780.050.4830.05抗体包被量（ng/孔）当控制阳性对照OD值在2.0以上，阴性对照OD值在0.05以下（小于0.05，以0.05计）时，有三个方案可满足此条件，为了减少实验成本，我们选择抗原包被量为200ng/孔，酶标抗体1:1000稀释作为本实验的最佳条件。13 实验I西北大学硕士研究生论文答辩温育时间的选择吸光度值随温育时间的变化本实验中，选用温育时间为25min，此时抗原抗体反应已达平衡，且时间波动对吸光度值影响较小。14 实验I西北大学硕士研究生论文答辩显色时间的选择5min10min15min阳性对照2.6912.860OUT阴性对照0.0630.0870.113不同显色时间下的检测结果本实验中，显色时间为15min时，非特异性的值较高，而显色10min和显色5min相比，阳性值和阴性值均变化不大，说明5min时，显色反应已达平衡。因此，选择5min作为最佳的显色时间。15 实验I西北大学硕士研究生论文答辩临界值(Cut-off)的确定16吸光度值OD=0.105阴性血样OD值分布平均值OD值：X=0.05根据常用的临界值判定标准来计算该方法的临界值，即为阴性对照平均值×2.1，阴性对照平均值<0.05时，阴性对照值以0.05计算，得Cut-off值为0.105，我们将OD=0.105作为本实验中判定阳性血样的临界值。 实验I西北大学硕士研究生论文答辩金磁微粒为载体HBsAg检测系统的精密性检测结果次数检测结果(扣除空白值)阳性检测平均值(扣除空白值)RSD(%)(批内-)1P2.0582.2242.1702.1112.2132.1562.91N0.050.050.050.050.052P1.8502.1322.2172.2302.2192.1306.77N0.050.050.050.050.053P2.1372.1112.1902.1572.1492.1491.20N0.050.050.050.050.054P2.0912.1322.2302.1622.2042.1632.29N0.050.050.050.050.055P2.0452.0772.1712.1022.1502.1092.19N0.050.050.050.050.05RSD(%)(批间-)2.03除一组检测外，方法的批内相对标准偏差（RSD）均小于5%，批间RSD仅为2.03%。另外，用该系统对HBsAg国家参考标准品也进行了精密度测定，检测10份样品的相对标准偏差（RSD）为8.3%，这符合HBsAg国家参考标准品的精密度要求（RSD应小于15%）。说明金磁微粒为载体HBsAg检测系统的精密性较好。17 实验I西北大学硕士研究生论文答辩灵敏度考察adr亚型阳性对照阴性对照0.2ng/mL0.5ng/mL1.0ng/mLOD（扣除空白）OUT0.050.1430.1540.145adw亚型阳性对照阴性对照0.5ng/mL1.0ng/mL2.0ng/mLOD（扣除空白）OUT0.050.1100.1770.300ay亚型阳性对照阴性对照0.5ng/mL1.0ng/mL2.0ng/mLOD（扣除空白）OUT0.050.0600.1080.184adr亚型阳性对照阴性对照0.2ng/ml0.5ng/ml1.0ng/mlOD（扣除空白）OUT0.050.050.0910.187adw亚型阳性对照阴性对照0.5ng/ml1.0ng/ml2.0ng/mlOD（扣除空白）OUT0.050.0370.0910.204ay亚型阳性对照阴性对照0.5ng/ml1.0ng/ml2.0ng/mlOD（扣除空白）OUT0.050.0260.0740.146金磁微粒为载体HBsAg检测系统的灵敏度检测结果商品化的ELISA试剂盒的灵敏度检测结果注：OUT表示所测值超出仪器的检测范围18 实验I西北大学硕士研究生论文答辩特异性考察用本系统检测HBsAg国家参考品的20份阴性血清及3份强阳性血清，结果显示，阴性符合率为100%(20/20)，阳性符合率为100%(3/3)。此外检测了203份献血者的血样，其结果与应用商品化试剂盒的结果一致。同时检测了81份HBsAg阴性献血者的血样，其阴性符合率为100%(81/81)。19阳性参考品1.4392.552.708阴性参考品0.0640.0710.0540.0460.0590.0820.0600.0510.0520.0670.0550.0520.0690.0530.0530.0540.0670.0550.0450.071 实验I西北大学硕士研究生论文答辩小结建立了以金磁微粒为载体，检测血清中HBsAg的方法。精密性试验表明，应用该法检测阳性血清及阴性血清时，方法的批内及批间相对标准偏差在1.20~7%的范围，符合临床检测要求。选用卫生部临床检验中心的HBsAg国家参考品对本系统进行灵敏度分析，结果显示乙肝病毒表面抗原adw，adr，ay三种亚型的最低检出浓度分别为0.5ng/ml，0.5ng/ml及1.0ng/ml；符合HBsAg国家参考品灵敏度检测的标准，且与目前商品化ELISA试剂盒的检测水平相当。用该方法检测献血员血清时，与商品化试剂盒的检测结果一致。金磁微粒包被抗体后，不影响其生物学活性，可成功应用于免疫学检测。研究和开发以其为载体的血液中HBsAg的免疫学检测方法对于血站筛查及临床研究具有非常重要的意义。20 实验II西北大学硕士研究生论文答辩Ⅱ.金磁微粒为载体的化学发光酶免疫分析法检测乙肝病毒表面抗原方法的建立HBsAb在金磁微粒表面的包被最佳化学发光检测条件的确定标准曲线的制作精密度考察21 实验II西北大学硕士研究生论文答辩HBsAb在金磁微粒表面的包被HBsAb包被前后的紫外吸收曲线22 实验II西北大学硕士研究生论文答辩化学发光检测缓冲体系的选择23缓冲体系对化学发光信号有很大的的影响。本实验中选择CBS体系为化学发光检测的最佳缓冲体系。同时选择CBS缓冲体系的最佳浓度为0.1mol/L。 实验II西北大学硕士研究生论文答辩体系pH值对化学发光信号的影响pH在8.0~9.5范围内，发光信号随pH升高而增强，在pH9.5时发光信号最大；pH值大于9.5时，发光信号随着pH值的增大而逐渐降低，所以本实验选择pH9.5，0.1mol/LCBS缓冲液为缓冲介质。24 实验II西北大学硕士研究生论文答辩发光试剂的浓度的选择实验中对鲁米诺、过氧化氢及对碘苯酚（PIP）的浓度对HBsAg测定的化学发光信号影响做了考察。结果表明，当鲁米诺溶液、过氧化氢溶液、对碘苯酚溶液的浓度分别为5×10-4mol/L,1×10-3mol/L和1×10-3mol/L时，化学发光信号值最大。因此，本实验选择鲁米诺溶液、过氧化氢溶液、对碘苯酚溶液的浓度分别5×10-4mol/L,1×10-3mol/L和1×10-3mol/L。25 实验II西北大学硕士研究生论文答辩检测体系的最优条件HBsAb包被量：200ng/孔；酶标抗体为1：1000稀释。温育时间：25分钟。化学发光检测的缓冲体系：pH9.5，0.1mol/LCBS缓冲液。鲁米诺溶液、过氧化氢溶液、对碘苯酚溶液的浓度分别5×10-4mol/L,1×10-3mol/L和1×10-3mol/L。26 实验II西北大学硕士研究生论文答辩HBsAg检测标准曲线的制作磁分离化学发光免疫法检测HBsAg的标准曲线HBsAg(10-12g/mL)020004000600080001000012000020040060080010001200相对光子数Y=9.329X+891.7R2=0.99627检测11份HBsAg阴性血清，根据IUPAC建议，计算得到本方法的检出限为8.6×10-4ng/mL。 实验II西北大学硕士研究生论文答辩精密度试验在线性范围内选取浓度为4×10-10g/mL的HBsAg标准品，重复测定11次，计算测定值的相对标准偏差RSD=6.8%。28 实验II西北大学硕士研究生论文答辩小结建立了以金磁微粒为载体的化学发光酶免疫分析定量检测HBsAg的方法。建立了HBsAg含量与其相应的发光信号值之间的回归曲线，线性良好，R2=0.996，检测范围为4~1100pg/mL。该方法检测HBsAg的最低检出限为8.6×10-4ng/mL，比目前商品化试剂盒（检出限通常为0.5~1ng/mL）的灵敏性提高了1000倍。29 全文总结以金磁复合微粒作为固相载体，将乙肝病毒表面抗体包被于金磁微粒表面。建立了双抗体夹心ELISA检测HBsAg的方法。用标准HBsAg血清盘对本方法进行了验证，结果表明，方法的批内及批间相对标准偏差在1.20~7%的范围；乙肝病毒表面抗原adw，adr，ay三种亚型的最低检出浓度分别为0.5ng/ml，0.5ng/ml及1.0ng/ml，其灵敏度与目前商品化ELISA试剂盒的检测结果相当；同时方法的精密性和特异性实验结果均符合HBsAg国家参考标准品的要求。西北大学硕士研究生论文答辩30 全文总结以金磁复合微粒作为固相载体，并引入Luminol-H2O2-HRP化学发光体系，以对碘苯酚（PIP）作为化学发光反应的增强剂，建立了检测HBsAg的化学发光酶免疫分析法。在检测体系的最优条件下，建立了HBsAg的浓度与其相对发光光子数值之间的标准曲线，线性良好，R2=0.996，线性范围为4~1100pg/mL，检测限为8.6×10-4ng/mL，其灵敏度较一般ELISA法大大提高。西北大学硕士研究生论文答辩31 致谢本论文是在导师崔亚丽教授的悉心指导和关怀帮助下完成的，首先我要向她表示我最诚挚的谢意。三年多来，崔老师在生活上、学习上、实验上都给了我极大的鼓励和帮助。崔老师严谨的治学态度、兢兢业业的工作态度、一丝不苟的科研精神、开阔新颖的思维方式、对学生既严格要求又给予无微不至的关怀，这些都给我树立了一个优秀的榜样，将成为我一生的财富。衷心感谢陈超教授为我提供了很多宝贵的学习机会和良好的实验平台，这些都是我论文完成的必要前提和基础。衷心感谢国家微检测系统工程中心的但宁教授、李铮教授、董兆麟教授，感谢你们平时对我的指导和无私的帮助。感谢西安交通大学的王朝辉教授及第四军医大学金伯泉教授在实验中给予的指导帮助，感谢西京医学输血检验科全体工作人员的无私帮助！感谢辛小芳、张彩峰、崔婷、王芬、彭明丽等全体员工，特别感谢我的师兄师姐及同学张连营、汪慧蓉、张志锋、曹树辉、李恒砚、李芳、李淑娟、唐一通、于桉、姚敏杰等对我实验和生活上的帮助，谢谢你们的真诚和关爱。也要感谢我的师弟杨柳及师妹刘蓓同学对我的无私帮助！感谢西北大学基因芯片研发中心全体成员对我工作的支持。他们创造了良好的工作环境和浓厚的学术气氛；他们创造了一个互相帮助，团结友爱的大家庭。让我在宽松愉快的气氛中完成学业。最后，我要感谢我的家人这么多年在我背后对我默默的支持、关怀与帮助，你们的爱我永远回报不尽！感谢答辩委员会的全体老师。谢谢你们！32'