惠普公司分析仪器部培训PPT-液体色谱硬件课件.ppt 27页

'第四章高效液相色谱硬件＄1输液系统输液系统的主要功能是向系统提供压力高、流速稳的流动相。输液系统以高压输液泵为中心，由溶剂贮槽、过滤器、输液泵、梯度溶剂混合器、阻尼器等组成。一、贮液槽贮液槽是盛放溶剂的容器，它可以是一个普通的溶剂瓶，或是一个专门设计的贮液槽。后者往往和泵通过管路构成一个循环系统，以便除去溶剂中的气体。现在仪器多数使用溶剂瓶与专门脱气设备串连。专门脱气设备包括：真空脱气，水泵脱气，超声脱气等。HP1100On-lineDegasser结构示意图1 二、过滤器为保护整个流路系统，在溶剂进口，泵进口，泵出口，色谱柱进口等处安装过滤芯。过滤芯的材料一般是聚四氟乙烯或不锈钢。孔隙小于10um。三、高压输液泵高压输液泵是液相色谱装置中最关键的设备，根据工作原理，高压输液泵可分为两类：恒流泵和恒压泵。恒压泵：主要指气动放大泵，泵出口压力在系统中是恒定的，流速由柱的阻力决定。恒流泵：包括往复柱塞泵和螺旋柱塞泵，这类泵输出的溶剂流量是恒定的，柱前的压力由柱后的阻力及系统气密性决定。恒压泵和恒流泵是指这两种泵的工作原理，并不表明泵的操作方式。借助于电子控制电路，往复泵和柱塞泵也可以按恒压方式操作。唯有气动放大泵只能恒压操作。1.气动放大泵气动放大泵是根据压力传递原理而设计的。气动泵有两个界面，气体推动的截面大，推动溶剂的截面小。由于截面两端压力相等，则输出截面的压强正比于两个截面的比值。只要这种比值足够大，则输出的溶剂可以获得很高的压力。气动放大泵示意图2 2.往复柱塞泵目前作为商品出售的高压恒流泵多为往复柱塞泵。在电机驱动下，柱塞杆在泵头内作作线性往复运动，完成将流动相吸入泵头然后再输出的过程。(1)工作过程在吸液过程中，由于柱塞的运动而在泵腔内形成负压。此时由于色谱柱的存在，泵头外的压力显然高于泵头内，在这种情况压差下，出口单向阀的宝石球落回到阀座上；而入口单向阀因为外界大气压大于泵腔内的压力，宝石球离开阀座，流动相顺利地进入泵腔在输液过程中，由于柱塞杆的运动使压力增加，入口单向阀的宝石落回到阀座，入口单向阀处于关闭状态；当泵头的压力继续增加，并且超过了泵头外的色谱柱的反压时，出口单向阀开启，流动相输出。3 (2)往复柱塞泵的特性往复柱塞泵每往复一次输出的流量由柱塞的截面积和冲程决定。单位时间输出的液体流量由单位时间内柱塞往复的次数决定。往复泵可以连续不断的以恒定的流量输送液体，同时更换溶剂非常方便，特别适用于梯度洗脱的需要。往复泵的缺点在于柱塞是往复运动地，输出流量和泵压力有波动性。在系统压力过高时有反吸现象。(3)多头往复泵为降低液体输送过程中所产生的脉动，最有效的方法是采用多头往复泵，由专门设计的驱动装置保证在任一瞬间都有液体输出，以降低波动。双柱塞往复串连泵(HP1100)双柱塞往复并联泵(HP1090)4 (4)四元泵（单元泵）（HP1100）四元泵（单元泵）属于双柱塞往复串连泵。一个伺服系统控制的可变阻尼马达从相反方向推动两个球形螺旋传动。球形螺旋传动的齿轮有不同的圆周（2：1），第一个活塞的运动速度是第二个活塞的两倍。四元泵启动时，通过运行一个初始程序来决定第一个活塞能到达的最高位置。第一个活塞慢慢向上移动至最高位置，然后从那向回移动一个预定的路径长度。控制器将这个活塞位置存贮在记忆中。完成初始化后，泵开始设定参数的操作。主动阀打开，向下移动的活塞将溶剂吸入第一个泵头，与此同时，第二个活塞向上移动，将溶剂送入系统。在完成一个由控制器决定的冲程长度后，驱动马达停止，主动阀关闭。马达反方向反转，移动第一个活塞向上至最高位置，同时移动第二个活塞向下。5 然后顺序重新开始将两个活塞上下移动。在第一个活塞向上移动时，泵头内的溶剂通过球形阀被压入第二个泵运单元。第二个活塞抽取第一个活塞排出体积的一半，余下的另一半体积直接运送至系统中。在第一个活塞抽区过程中，第二个活塞将抽取的体积运送到系统中。(5)二元泵6 二元泵是指一个泵腔内含有两个相同的泵，它通过高压混合产生梯度，二元泵不包括真空脱气装置，但真空脱气机可以作为单独的产品定购，在需要最好的流动稳定性时使用，特别是在低流速或最大检测灵敏度时。二元泵中每个泵的工作原理与四元泵（单元泵相同）3.螺旋柱塞泵因其工作原理与注射器类似，也称为注射泵。螺旋柱塞泵和往复泵的原理完全不同。电机以一定的转速通过螺杆旋转驱动柱塞上下移动。柱塞向下移动时，将液体吸入缸内，一次吸入数十毫升，可快速进行。柱塞向上移动时将液体排出。流量通过电机转速控制。12345671－溶剂出口2－三通阀3－溶剂入口4－溶剂室5－活动密封6－螺旋推动柱塞7－转速驱动装置7 螺旋柱塞泵的优点：升压快，操作压力高，输液过程没有脉动。螺旋柱塞泵的缺点：溶剂容量有限，给分析工作待来不便。同时由于加工成本高，现在液相色谱中已经很少使用。四、梯度洗脱装置根据溶剂混合的原理不同，梯度洗脱装置可分成两类：低压梯度和高压梯度1.低压梯度洗脱（泵前混合）8 低压梯度：溶剂在常压下混合，然后用一个高压输液泵把混合液输送至系统中。方法简单、经济，而且只需一个泵，所用溶剂元数没有限制（一般最多为四元）。2.高压梯度（泵后混合）高压梯度：溶剂首先经过高压泵加压，然后在混合室内混合。高压梯度一般使用两台高压输液泵，每台输送一种溶剂。9 五、阻尼器阻尼器又称缓冲器，是为减少流量波动而设置的，它安装在往复泵两个泵腔之间。10 ＄2进样系统在液相色谱中，进样方式有三种：柱头进样，六通阀进样，自动进样。三种进样方式中，最理想的进样方式是柱头进样，但由于实践起来困难很大，因此在常规分析中主要采用六通阀进样或自动进样。一、六通阀进样11 六通阀与整个系统的连接方法12 2.自动进样器MainpassBypassLoadingInjectandRun13 $3检测器一、概述检测器的作用是将从色谱柱中流出的物质量的变化，转变成可供观测或检测的信号，通常为电压信号。该信号再通过记录仪、积分仪或色谱工作站等进行色谱数据处理。对于液相色谱而言，由于待分离样品的所有组分均溶于流动相中而处于液相状态，样品与样品、样品与流动相之间各种物理性质接近，因此要寻找出一种即通用又灵敏的检测方法比较困难，至今为止检测器的技术问题仍然是HPLC中的薄弱环节。目前，HPLC中使用的检测器种类较多，分类也比较混乱。1.按检测器用途分类：检测器可分为通用型检测器（加和性质）和选择性检测器（溶质性质）。通用型检测器是利用连续测定色谱柱流出物质某些具有普遍性的物理参数如折光指数、介电常数等而设计的检测器。根据吸馏液（样品与溶剂的混合物）与溶剂相同性质的差别检测被分析物质。这种检测器具有广泛的适用性，但灵敏度低，容易受外界因素如温度、流速、流动相组成等的影响，因此限制了使用范围。选择性检测器是利用测定某些物质特有的性质如紫外吸收、荧光等而设计的检测器，一般来说其灵敏度要比通用型检测器的灵敏度高102～103倍或者更高，并且受外界因素包括流动相的组成变化影响极小或者没有，但是在使用上仅限于测定对检测器有相应的物质。2.按检测器测量性质分类：检测器可分为浓度型检测器和质量型检测器。浓度型检测器是连续测定样品溶液的浓度变化，是反映总体性质的检测器，例如紫外、荧光或示差检测器就属于此类。质量型检测器是测量样品的总量，库仑、同位素或质谱检测器就属于这一类。14 3.按测量原理分类：检测器可分为光学检测器和电学检测器。由于检测器是影响色谱中的薄弱环节，所以世界各国在研究开发方面投入了大量的精力和财力。从目前发表的文献统计数据来看，光学检测器（包括紫外、示差、荧光检测器等）的应用占绝对多数，随着二极管阵列检测器的推广和应用，这一比例还会增加。其次发展速度较快的是电学型检测器（例如电化学、电导检测器等）。另外各国也正在积极地开展HPLC与IR、MS、NMR等的联用技术。二、检测器的性能影响色谱检测器的性能指标通常用以下几项来描述：灵敏度、最低检出限、线性范围、噪音与漂移、峰形的展宽，当然还有操作适应性、维修的方便与否等因素。15 1.灵敏度液相色谱检测器的灵敏度通常用两种表示方法：对于加和性质检测器，灵敏度Sc＝△Rc/△CRc是响应值，通常以峰面积表示。在液相色谱中由于检测器的检测原理各异，响应值直接反映物理性质的变化，但有时响应值也用其特有的物理量来表示，如折光指数单位(R.I.u)。C是洗馏物中溶质的浓度，显然与流动相流速有关。对于溶质性质检测器，灵敏度Sm＝△Rm/△wRm是溶质性质检测器的响应值，如吸光度等。W是溶质量。在信号单纯以电信号或峰面积表示时，上面的公式可分别写成：Sc=AF/wSm=A/wA是峰面积，F是流动相的体积流速，w是溶质量检测器灵敏度有不同的定义，同时灵敏度也不能严格地表示检测器的检测能力，因为它没有考虑检测器输出的噪音水平。如果噪音很大，即使灵敏度高也难以检测痕量组分。16 2.综合考察仪器的性能指标一般用信噪比(S/N)、最低检出限和线性范围三个参数。信噪比：信号响应值与噪音之比。最低检出限：通常定义为两倍于基线噪音信号的样品量或浓度。线性范围：检测器输出信号与样品浓度（或量）呈线性关系的范围。线性范围的下限是检测器的最低检出限（D），上限是灵敏度变化不超过5％时最大允许的质量流速(Mmax)和样品浓度(Cmax)。线性范围的计算：Lr=Mmax/D和Lr=Cmax/D线性范围宽有利于样品定量分析方法的选择。三、检测器的类型1.紫外检测器检测原理：依据郎布－比耳定律Log=A=abcIoIIo--入射光强度I--透过光强度A--吸收度a--在测定波长的消光系数b--光程池的长度c--样品浓度17 检测器结构（可变波长检测器）可变波长检测器采用氘灯作光源，波长在190～600nm范围可调。光源发出的光经过透镜聚焦在入口狭缝上，光透过狭缝经过反射到达光栅，光栅把190～600范围的光分成不同波长的单色光后，把某一波长的单色光经过平面镜反射至光分束器。透过分束器的光经过样品池最终到达样品光电二极管检测器倍检测；被光分束器反射的光到达参比检测器被检测。紫外检测器的这种设计，使得它在某一时刻只能采集某一特定波长。为了对色谱过程中各个峰都获得最灵敏的检测，光栅可以编程控制，便于采集过程中变化波长。紫外检测器适用范围紫外检测器不是通用型检测器，可以检测有∏键及非共用电子对的物质，如烯烃，芳烃以及含C＝O，C＝S，N＝O，N＝N基团的化合物，这些化合物在紫外区都有吸收。18 2.二极管阵列检测器检测原理：与紫外检测器相同，严格地讲，二极管阵列检测器是紫外检测器的一种，但光路系统与紫外检测器有很大差别。检测器结构二极管阵列检测器采用氘灯与钨灯组合光源（HP1100），采用特殊的后置灯设计，使钨灯灯丝的影像恰好聚焦在氘灯放电处，从而在光学上把两个光源结合在一起，使它们发出的光共用一个光轴进入光源透镜。光源发出的复合光经过消色差透镜，聚焦在流动池，然后光束在全息光栅的表面色散并投射到二极管阵列上。二极管阵列由若干个二极管组成（HP1100由1024个二极管组成），每个二极管负责测定一窄段光谱。通过测量固态线路开关接到公共输出线上的贮存电容的电荷量来测出光电二极管所接收的光强。与普通的光谱检测器相比，它的样品池与光栅的位置正好相反，因此这种结构常常被称为“倒光学”系统。19 应用范围：与紫外检测器相同。由于紫外检测器在某一时刻只能采集某一特定波长，因而它只能测定光谱中某一点的吸收值，不能采集整个光谱，如果需要化合物的光谱，必须停泵扫描。但二极管阵列检测器通过全息光栅将光线分散到二极管阵列上，这样可以得到整个光谱信息，无需停泵扫描即可得到化合物的紫外光谱。所以，对于二极管阵列检测器，除了提供一般色谱的二维信息（时间－强度），还通过了化合物的光谱信息即提供三维信息（时间－强度－波长）。利用二极管阵列检测器可以进行最大波长选择、谱图检索、峰纯度检测。20 3.示差折光检测器检测原理：每一种物质在一定温度、压力下都有固定的折光指数。样品组分从柱中洗馏出来与流动相组成一混合物，它的折光指数与纯流动相或纯溶质都不同。示差折光检测器以纯溶剂作参照物，连续检测柱后洗馏液折光指数的变化，并根据变化的差值决定样品中各组分的量。检测器结构：A－光源B－狭缝C－样品池D－参比池E－反射镜F－光平衡镜片G－光电检测器示差折光检测器光路图21 光源A发出的光经过狭缝B到达检测池，检测池被对角分隔开成两部分－C为样品流动池，D为参比流动池，光线通过流动池后被反光镜E反射回来再经过一次流动池后到达光学平衡镜片F，此镜片的位置可以通过马达来调节。经过平衡镜片的光束最后到达光电检测器G被检测。光电检测器由两个光电二极管组成。示差折光检测器流路图A－共有B－通常关闭C－通常打开常规状态Flush状态22 开始时，流动池的两部分均添满纯流动相，参比池流路关闭，流动相只经过样品池。在这中情况下，流动相在两个流动池中有相同的折光指数。此时，光学平衡镜片调节位置以便落在每个光电二极管上的光强度相等。当有样品流经样品池时，引起折光指数的改变。折光指数的改变引起经过样品池的光束发生偏差，造成落在每个二极管的光强不相等，由于二极管所产生的光电电流与落在二极管上的光强成正比，所以由于存在光强的差异引起光电电流的改变，这种变化被放大检测，得到检测信号。检测器应用范围：示差折光检测器是通用型检测器，对任何物质均有响应，但对温度变化，流量变化，梯度变化均很敏感。4荧光检测器检测原理：当多原子分子吸收光量子时，电子从基态的最低振动能级跃迁到高电子能态。然后分子通过无辐射过程松弛到一种激发态的最低振动能级，并在回到基态时发射光子，这个过程称之为荧光。由于发射前后的振动松弛，荧光发射的能量总低于吸收的能量。因此溶液中溶质分子的荧光光谱与吸收光谱相比总出现在长波长区。在色谱条件下，由于溶质浓度很低，荧光强度If与激发光强度I0的关系可以近似写成：If＝2.3ΦfI0εLcΦf量子效率;ε-溶质摩尔吸光系数;L-光程长(即池体长度)，c为样品浓度。此式是荧光检测器定量的基础。通过增加激发光强度I0，可以提高检测器的灵敏度。检测限可达1pg(10-12g)，线性为浓度的2～3个数量级。23 检测器结构从氘灯或氙灯发出的激发光首先聚焦在第一个光栅，此光栅通过转动选择需要的激发波长聚焦在流动池。样品经过激发光的照射后发出荧光，荧光经过聚焦和反射，到达第二个光栅，第二个光栅经过转动选择检测合适波长的荧光反射到检测器检测。使用荧光检测器时，要注意流动相组成对荧光发射的影响。溶剂自身的极性、pH值、氧的含量、溶剂的氢键作用等都会影响荧光的发射强度或发射波长。溶剂中的杂质，特别是氧的含量，可能完全抑制低荧光化合物发射的信号，因而溶剂需要脱氧。24 应用范围荧光检测器用于检测能够发射荧光的化合物，但本身具有荧光特性的有机或者无机化合物很少，可以通过衍生的方法使原来不发荧光的化合物发射荧光，进而对其进行检测。下面表格列出某些固有发射荧光的物质。25 四、几种常见检测器之间性能比较检测器名称紫外荧光示差安培测量参数消光值荧光强度折射率电流检测能力(g/ml)10-9~10-1010-1010-710-10线性动态范围104102~104103~104104~105噪音(测量参数单位)1×104－10-7~10-810-9能否用于梯度洗脱能能不能有限的对温度的依赖性小小大中对流量的依赖性没有没有有有26 BLC4-18NecessityforMorethanOneDetectorFlecainideinSerumTherapeuticconcentration:1.8mg/l,20ulinjectedUVandfluorescencesignalFLsignalUVsignalSelectivity27'