微生物生理教学课件PPT 119页

'第四章微生物生理主要内容：生物的酶微生物的营养微生物的能量代谢微生物的合成代谢 酶是一类由活性细胞产生的具有催化作用和高度专一性的特殊蛋白质。简单说，酶是一类由活性细胞产生的生物催化剂。辅基全酶=酶蛋白+辅助因子辅酶一、酶的概念第一节酶(Enzyme) 第一节酶（续）二、酶的催化特性1．酶积极参与生物化学反应，加速反应速度，但不能改变反应平衡点，在反应前后无变化；2．酶的催化作用具有专一性；一种酶只能作用于一种物质或一类物质，或者说只能催化一种或一类化学反应；3．酶的催化作用条件温和；在常温、常压和近中性的水溶液中进行（生物体内环境）；4．酶对环境条件极为敏感；高温、强酸、强碱、重金属离子等会能使酶丧失活性；由于酶是蛋白质，容易失活；5．酶具有极高的催化效率；如过氧化氢酶的催化效率比铁离子Fe3+（一般催化剂）要高1010倍。 第一节酶（续）三、酶的组成酶的组成有两类：（1）单成分酶：只有蛋白质；（2）全酶：由蛋白质和非蛋白成分组成。非蛋白成分可以是：有机物、金属离子、有机物和金属离子。通常把它分为辅酶和辅基，与酶蛋白结合得牢的，称为辅基，与酶蛋白结合得不牢的，称为辅酶。 第一节酶（续）常见的辅酶和辅基有：辅酶A（CoA或CoASH）、NAD（辅酶I）和NADP（辅酶II）、FMN（黄素单核苷酸）和FAD（黄素腺嘌呤二核苷酸）、辅酶Q（CoQ）、磷酸腺苷及其他核苷酸类（包括AMP、ADP、ATP、GTP、UTP、CTP等）。专性厌氧菌特有的辅酶：辅酶M、F420（辅酶420）、F430（辅酶430）等。 第一节酶（续）四、酶的活性中心酶的活性中心：酶蛋白分子中与底物结合，并起催化作用的小部分氨基酸微区。组成酶的活性中心，可以是蛋白质多肽链上不同位置的氨基酸区域。活性中心可分为结合部位和催化部位。只有酶蛋白保持一定的空间构型，酶的活性中心才能存在。如果酶蛋白发生变性，构成酶活性中心的基团互相分开，酶与底物将无法形成结合，酶促反应也就无法进行。 第一节酶（续）在酶（双成分酶）的非蛋白成分上，具有催化功能的那一部分，称为活性基，它决定着催化反应的性质，担负着传递电子、原子或化学基团的功能。单独的酶蛋白没有酶活性或活性很低，只有与活性基结合，才显示出酶的高度专一性和强大催化效率。酶与底物结合的机理 第一节酶（续）五、酶的分类与命名根据不同的标准，有不同的分法：1．按照酶所催化的化学反应类型，可分为6大类，这也是国际上的标准分法，由此进行编号：（因此其顺序也是很重要的）（注意：教材的顺序是错误的）（1）氧化还原酶类（氧化还原反应）AH2+B→A+BH2还可进一步分为氧化酶和脱氢酶。（2）转移酶类（底物的基团转移到另一有机物上）A-R+B→A+B-RR可以是氨基、醛基、酮基、磷酸基等。 第一节酶（续）（3）水解酶类(大分子有机物水解)A-B+HOH→AOH+BH（4）裂解酶类（有机物裂解成小分子物质）AB→A+B（5）异构酶类（同分异构体之间的转化）A→A’（6）合成酶类（底物的合成反应，需要能量）A+B+nATP→AB+nADP+nPi 第一节酶（续）根据催化反应的性质将酶分为六大类，在每一大类中又可分为若干亚类和亚亚类，并采取四位编号的系统。每种酶都有一个四位数字的号码，每个酶用4个用圆点隔开的数字编号，编号前冠以EC（EnzymeCommission），其中第一位数代表大类；第二、三位数分别代表亚类和亚亚类，由前三位数就可确定反应的性质；第四位数则是酶在该亚亚类中的顺序。例如，L-乳酸:NAD氧化还原酶（乳酸脱氢酶）的四位编号是EC1.1.1.27。其中第一的1是指氧化还原酶大类；第二位的1是指该酶作用于底物的CHOH基，使之脱氢；第三位的1表明受氢体是NAD+，第四位的27是这个酶的序号。 第一节酶（续）2．按酶作用的部位，可分为：胞外酶、胞内酶和表面酶。3．按酶作用的底物的不同，可把酶分为淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、核糖核苷酶等。（属于习惯性的分类法）4．按照酶在生物体内存在的状况,可分成固有酶和诱导酶：固有酶，也称为组成酶（constitutiveenzyme），无论培养基中有无它们的底物，这种酶都能形成。诱导酶，也称为适应酶（adaptiveemzyme），只有在培养基中存在其底物时才能形成。如在E.coli中的利用乳糖的酶就是适应酶。 第一节酶（续）诱导酶的意义：诱导酶的产生，是一个十分复杂的过程，与外界物质（底物）的存在有关，也与生物体内基因的调控有关。这种适应现象对生物来说是一种节约，在环境工程领域具有其意义。因为在环境保护领域，经常会遇到一些在自然界不常见的物质，微生物的适应能力，使对这些物质的降解成为可能。 第一节酶（续）七、酶的活性和影响酶活力的因素一般都是根据酶的催化效果来测定酶的含量，也就是测定酶所催化的反应速度反应速度----单位时间内底物的消失量或产物的生成量。衡量酶的数量指标：酶活力----在温度25℃、最适pH、最适的缓冲溶液和最佳底物浓度等诸条件下，每分钟能使1微摩尔的底物转化的酶量为一个酶活力单位（IU或U）。比活力----在固定条件下，每毫克酶蛋白或每毫升酶液所具有的酶活力。 第一节酶（续）酶反应机理(反应动力学)——中间产物学说Michaelis&Menten提出的中间反应学说：k1k3E+SESE+Pk2米氏公式：由上述中间反应，根据质量作用定律，导出酶促反应速度方程式：（米-门公式）：V=VmaxS/(Km+S)[Km=(k2+k3)/k1] 第一节酶（续）米氏常数Km的含义：（1）当V=Vmax/2时，Km=S，故它是反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度；（2）Km=(k2+k3)/k1，表示酶与底物的反应完全程度，Km越小，表明酶与底物的反应越趋于完全，Km越大，表明酶与底物的反应越不完全。对米氏公式作图，可以看到下述关系： 第一节酶（续）米氏常数的求法：Lineweaver-Burk图解法1/V=1/Vmax+(Km/Vmax)(1/S) 第一节酶（续）1．酶浓度对酶促反应的影响酶促反应速度与酶分子浓度成正比。当底物分子浓度足够时，酶分子越多，底物转化的速度越快。 第一节酶（续）2．底物浓度对酶促反应的影响在生化反应中，若酶的浓度为定值，底物的起始浓度较低时，酶促反应速度与底物浓度成正比，即随底物浓度的增加而增加。当所有的酶与底物结合生成ES后，即使再增加底物浓度，中间产物浓度[ES]也不会增加，酶促反应速度也不增加在底物浓度相同的条件下，酶促反应速度与酶的初始浓度成正比。酶的初始浓度大，其酶促反应速度就大。 第一节酶（续）3．温度对酶促反应的影响各种酶在最适温度范围内，酶活性最强，酶促反应速度最大。在适宜的温度范围内，温度每升高10℃，酶促反应速度可相应提高1-2倍。用温度系数Q10来表示温度对酶促反应的影响。Q10表示温度每升高10℃，酶促反应速度随之相应提高的因数。酶促反应的Q10通常在1.4-2.0之间，小于无机催化反应和一般化学反应的Q10。Q10=在（T+10）时的反应速度/在T时的反应速度 第一节酶（续）但并不是温度越高越好，有一个适应的范围，一般微生物的温度最适范围在25~60℃。温度的影响存在三基点：最高、最适、最低。温度过高会破坏酶蛋白，造成变性；（约60℃）温度过低会使酶作用降低或停止，但可以恢复。（约4℃）不同微生物的温度适应范围不同。 第一节酶（续）4．pH对酶促反应的影响同样存在三基点：最高、最适、最低。酶在最适pH范围内表现出活性，大于或小于最适pH，都会降低酶活性。pH对酶活力的影响主要表现在两个方面：（1）改变底物分子和酶分子的带电状态，从而影响酶和底物的结合；（2）过高、过低的pH都会影响酶的稳定性，进而使酶遭到不可逆的破坏。 第一节酶（续）5．激活剂对酶促反应的影响能激活酶的物质称为酶的激活剂。激活剂种类很多，有无机阳离子、无机阴离子、有机化合物等。许多酶只有当某一种适当的激活剂存在时，才表现出催化活性或强化其催化活性，这称为对酶的激活作用。例如，金属离子的激活作用起了某种搭桥作用，它先与酶结合，再与底物结合，形成酶-金属-底物的复合物。而有些酶被合成后呈现无活性状态，这种酶称为酶原。它必须经过适当的激活剂激活后才具有活性。如胰蛋白酶刚合成时，没有活性，为胰蛋白酶原，需经肠激酶激活后才具有活性。又如酵母磷酸葡萄糖变位酶，需1~3×10-3M的Mg2+进行激活，其活性可以增加6.6倍。 第一节酶（续）6．抑制剂对酶促反应的影响能减弱、抑制甚至破坏酶活性的物质称为酶的抑制剂。抑制剂可降低酶促反应速度。酶的抑制剂有重金属离子、一氧化碳、硫化氢、氰氢酸、氟化物、碘化乙酸、生物碱、染料、对-氯汞苯甲酸、二异丙基氟磷酸、乙二胺四乙酸、表面活性剂等。 第一节酶（续）对酶促反应的抑制可分竞争性抑制和非竞争性抑制。与底物结构类似的物质争先与酶的活性中心结合，从而降低酶促反应速度，这种作用称为竞争性抑制。竞争性抑制是可逆性抑制，通过增加底物浓度最终可解除抑制，恢复酶的活性。与底物的结构类似的物质称为竞争性抑制剂。抑制剂与酶活性中心以外的位点结合后，底物仍可与酶活性中心结合，但酶不显示活性，这种作用称为非竞争性抑制。非竞争性抑制是不可逆的，增加底物浓度并不能解除对酶活性的抑制。与酶活性中心以外的位点结合的抑制剂，称为非竞争性抑制剂。有的物质既可作一种酶的抑制剂，又可作另一种酶的激活剂。 第二节微生物的营养新陈代谢过程：微生物从外界不断地摄取营养物质，经过一系列的生物化学反应，转变成细胞的组分，同时产生废物并排泄到体外，这个过程称为新陈代谢（代谢）。新陈代谢包括同化作用（物质合成，吸收能量）和异化作用（物质分解，释放能量）。两者是相辅相成的：异化作用为同化作用提供物质基础和能量。同化作用为异化作用提供基质。 了解微生物的营养及其所需营养物的种类和数量，首先要了解微生物的化学组成、元素组成和生理特性。一、微生物的化学组成化学（物质）组成：微生物体内，70-90%为水分，10-30%为干物质。水：各类微生物细胞内均含有大量的水分，如细菌为75-85%、酵母菌为70-85%、霉菌为85-90%，芽孢的水分最少，仅40%，这与它的生理功能有关（抵抗不良环境）。水是生命活动不可缺少的重要物质，它是多种物质的良好溶剂，各种生理活动都离不开水。营养物质：满足机体生长、繁殖和生理活动的物质营养：获取和利用营养物质的过程。 元素组成：（1）C、H、O、N：为所有生物体的有机元素。在生物体内大量存在，占90-97%，是组成有机体的主要元素。除此之外的元素为矿质元素，又可分为：（2）大量元素：包括P、S、K、Na、Ca、Mg、Cl等。它们与细胞结构，物质组成，能量转移，原生质胶体状的维持等有关。（3）微量元素：包括Fe、Cu、Mn、B、Mo、Co、Si等，含量极微，但却是不可缺少的，具有一些特殊的功能，如酶的激活等。当然，微生物的化学组成并不是绝对不变的，它往往会由于菌龄的不同和培养条件的改变而发生变化。干物质：其中有机物占干重的90-97%，无机物占3-10%；有机物主要是蛋白质、糖类（碳水化合物）、核酸、脂类等，无机物则是各类元素。 根据微生物有机元素组成分析数据，可得到化学组成实验式。如霉菌是C12H18O7N，它不是分子式，只是用来说明组成有机体的各种元素之间的比例关系，可供在培养微生物时作为提供营养的参考。从实验所得数据可以求出化学组成实验式：重量百分比→摩尔百分比→以氮为1，求出相对比值→四舍五入，最后得到化学组成实验式 二、微生物的营养物及营养类型从微生物的化学组成中，我们可以看到：微生物首先需要大量的水分；需要较多地供给构成有机物碳架和含氮物质的碳元素和氮元素；另外，还需要一些含P、Mg、K、Ca、Na、S等的盐类，及微量的Fe、Cu、Zn、Mn等元素。因此，除了某些特殊要求的微生物外，培养一般微生物必须提供上述这些营养物质，微生物才能正常地生长繁殖。 水微生物营养物质碳素化合物氮素化合物矿质元素生长因子（一）微生物需要的营养物质能源 1.水水是微生物机体的组成部分，同时又是微生物代谢过程中必不可少的。它的作用体现在两方面，一是有助于营养物质的吸收利用（先溶解于水）；二是保证各种生化反应的进行（须在水溶液中进行）。2.碳源和能源(sourceofcarbon)凡能供给微生物碳素营养的物质，称为碳源。碳源的主要作用:是构成微生物细胞的含碳物质(碳架)和供给微生物生长、繁殖及运动所需要的能量。 充当碳源的物质，往往同时又是能量的提供者（自然界中含碳的有机物，一般都含有较高的能量，在被分解时能释放出来，为微生物所利用）。从简单的无机碳化合物到复杂的有机含碳化合物，都可作为碳源。例如，糖类、脂肪、氨基酸、蛋白质、脂肪酸、丙酮酸、柠檬酸、淀粉、纤维素、半纤维素、果胶、木质素，醇类、醛类、烷烃类、芳香族化合物(如酚、萘、菲及蒽等)、氰化物(如氰化钾、氰氢酸和丙烯腈)，各种低浓度的染料等。少数微生物还能以CO2或CO32-中的碳素为唯一的或主要/的碳源。微生物细胞中的碳素含量相当高，占干物质质量的50%左右。可见，微生物对碳素的需求量最大。 种类碳源物质备注糖葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉、半乳糖、乳糖、甘露糖、纤维二糖、纤维素、半纤维素、甲壳素、木质素等单糖优于双糖，己糖优于戊糖，淀粉优于纤维素，纯多糖优于杂多糖。有机酸糖酸、乳酸、柠檬酸、延胡索酸、低级脂肪酸、高级脂肪酸、氨基酸等与糖类比效果较差，有机酸较难进入细胞，进入细胞后会导致pH下降。当环境中缺乏碳源物质时，氨基酸可被微生物作为碳源利用。醇乙醇在低浓度条件下被某些酵母菌和醋酸菌利用。脂脂肪、磷脂主要利用脂肪，在特定条件下将磷脂分解为甘油和脂肪酸而加以利用。烃天然气、石油、石油馏分、石蜡油等利用烃的微生物细胞表面有一种由糖脂组成的特殊吸收系统，可将难溶的烃充分乳化后吸收利用。CO2CO2为自养微生物所利用。碳酸盐NaHCO3、CaCO3、白垩等为自养微生物所利用。其他芳香族化合物、氰化物蛋白质、核酸等利用这些物质的微生物在环境保护方面有重要作用。当环境中缺乏碳源物质时，可被微生物作为碳源而降解利用。 3、氮源(sourceofnitrogen)凡是可以被微生物用来构成细胞物质的或代谢产物中氮素来源的营养物质通称为氮源物质。氮源的作用是提供微生物合成蛋白质的原料（一般不充当能源）。能被微生物所利用的氮源物质有蛋白质及其各类降解产物、铵盐、硝酸盐、亚硝酸盐、分子态氮、嘌呤、嘧啶、脲、酰胺、氰化物。 种类氮源物质备注蛋白质类蛋白质及其不同程度降解产物(胨、肽、氨基酸等)大分子蛋白质难进入细胞，一些真菌和少数细菌能分泌胞外蛋白酶，将大分子蛋白质降解利用，而多数细菌只能利用相对分子质量较小其降解产物氨及铵盐NH3、(NH4)2SO4等容易被微生物吸收利用硝酸盐KNO3等容易被微生物吸收利用分子氮N2固氮微生物可利用，但当环境中有化合态氮源时，固氮微生物就失去固氮能力其他嘌呤、嘧啶、脲、胺、酰胺、氰化物大肠杆菌不能以嘧啶作为唯一氮源，在氮限量的葡萄糖培养基上生长时，可通过诱导作用先合成分解嘧啶的酶，然后再分解并利用嘧啶可不同程度地被微生物作为氮源加以利用 根据对氮源要求的不同，将微生物分为4类：（1）固氮微生物这类微生物能利用空气中的氮分子(N2)合成自身的氨基酸和蛋白质。如固氮菌、根瘤菌和固氮蓝藻。（2）利用无机氮作为氮源的微生物能利用氨(NH3)、铵盐(NH4+)、亚硝酸盐(NO2-)、硝酸盐(NO3-)的微生物有亚硝化细菌、硝化细菌、大肠杆菌、产气杆菌、枯草杆菌、铜绿色假单胞菌、放线菌、霉菌、酵母菌及藻类等。 （3）需要某种氨基酸作为氮源的微生物这类微生物叫氨基酸异养微生物。如乳酸细菌、丙酸细菌等。它们不能利用简单的无机氮化物合成蛋白质，而必须供给某些现成的氨基酸才能生长繁殖。（4）从分解蛋白质中取得铵盐或氨基酸的微生物这类微生物如氨化细菌、霉菌、酵母菌及一些腐败细菌，它们都有分解蛋白质的能力，产生NH3、氨基酸和肽，进而合成细胞蛋白质。 4.无机盐无机盐的生理功能包括（1）构成细胞组分；（2）构成酶的组分和维持酶的活性；（3）调节渗透压、氢离子浓度、氧化还原电位等；（4）供给自养微生物能源。微生物需要的无机盐有磷酸盐、硫酸盐、氯化物、碳酸盐、碳酸氢盐。这无机盐中含有钾、钠、钙、镁、铁等元素，其中，微生物对磷和硫的需求量最大。此外，微生物还需要锌、锰、钴、铂、铜、硼、钒、镍等微量元素。 5.生长因子（因素）指一些微生物维持正常生活所必需而需要量又不大的特殊营养物。包括：维生素，氨基酸，嘌呤、嘧啶等类物质。各种微生物对生长因素的要求不同。很多异养微生物及自养微生物具有合成生长因子的能力，所以，它们可以不必从外界环境中获取现成的生长因子，因为它们可以自己合成本身所需要的生长因子。但对有些微生物，自己不能合成时，则必需供给生长因子，方能生长繁殖。 生长因子分：维生素、氨基酸、嘌呤和嘧啶维生素－－辅酶缺乏合成某种aa能力－－补充aa。如：肠膜明串珠菌需17种aa嘌呤和嘧啶－－辅酶及合成核苷等 根据碳源、能源及电子供体等分为：光能无机自养：光为能源，利用无机物为碳源光能有机异养：光为能源，生长需要有机物质化能无机自养：无机物氧化供能，生长不依赖有机物化能有机异养：有机物氧化供能，生长依赖有机物（二）微生物的营养类型(nutritionaltypes) 划分依据营养类型特点碳源自养型以CO2为唯一或主要碳源异养型有机物能源光能营养型光为能源化能营养型有机物氧化的化学能电子供体无机营养型还原无机物为e供体有机营养型有机物为e供体微生物营养类型 微生物营养类型总结（根据碳源和能源的不同）：能源碳源例光能自养型光CO2藻类化能自养型无机物CO2硝化细菌光能异养型光有机物光合细菌化能异养型有机物有机物大多数细菌等 另外:.混合营养微生物混合营养微生物是既可以利用无机碳(CO2、CO32-等)作为碳素营养，又可以利用有机碳化合物作为碳素营养，即为兼性自养微生物。例如，氢细菌属、贝日阿托氏菌属、发硫菌属、亮发菌属、新型硫杆菌、反硝化硫杆菌，上述细菌既可以S、H2S为能源，也能以低浓度的乙酸钠、琥珀酸及葡萄糖为能源和碳源。据报导，硝化细菌的某些株能以乙酸为碳源。微生物往往首先利用现成的容易被吸收利用的有机物质。 三、碳氮磷比水、碳源、氮源、无机盐及生长因子为微生物共同需要的物质。由于不同微生物细胞的元素组成比例不同，对各营养元素的比例要求也不同。在实际中，主要是指碳氮比（或碳氮磷比）。如根瘤菌要求碳氮比为11.5:1，霉菌为9:1。在废水处理中，活性污泥中好氧微生物要求碳氮磷比为BOD5:N:P=100:5:1。为了保证生物处理效果，要按碳氮磷比配给营养。有时某种营养缺乏，应供给或补足。但也不可盲目添加，否则会导致反驯化。 四、、培养基（culturemedium）培养基：根据微生物的营养要求，将各种营养物质按一定比例配制而成，用以培养微生物的基质。在培养基中，应该含有微生物生长繁殖必需的营养条件，并且浓度比例等合适。不同微生物的要求不同。不同的培养目的，所要求的营养物质也不同。 培养基实例：肉汤培养基（用于培养细菌的基础培养基)牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCL5g，水1000ml，pH7.0-7.2。若是固体培养基，则加入琼脂15g-30g水生4号培养基（用于藻类的培养）Ca(H2PO4)2·H2O+2(CuSO4·7H2O)0.03g(NH4)2SO40.2gMgSO4·7H2O0.08gNaHCO30.1gKCl0.025gFeCl3(1%)0.15ml水1000ml土壤浸出液0.5ml 1、选择适宜的营养物质首先考虑不同微生物营养需要，如：自养、异养细菌一般肉汤培养基；放线菌高氏1号合成培养基；酵母菌麦芽汁培养基；等（一）选用和设计培养基的原则和方法 2、营养物质浓度及配比合适C：N影响大，如：Glu发酵时C:N为4:1时菌体大量生长；3:1时Glu大量积累。3、pH细菌、放线菌7～7.5；霉菌和酵母4.5～6。在微生物生长过程中会有变化，所以需要加缓冲剂，最常见的是磷酸盐缓冲剂(6.4~7.2)若是大量产酸可加入难溶的碳酸盐中和。aa、肽、蛋白两性电解质也有缓冲作用。 4、氧还电位（Φ）好氧生物Φ＋0.1V以上可以生长，一般0.3～0.4V适宜厌氧在低于0.1V生长兼性在0.1V以上好氧呼吸，低于0.1V发酵通过控制通气量或加氧化剂增加Φ，加还原剂降低Φ。5、原料来源廉价、易得、降低成本 6、灭菌处理培养基高压蒸汽1.05kg/cm2，121.3℃15～30"不耐热的如：含G的0.56kg/cm2，112.6℃15～30’对糖要求较高的可用过虑除菌或间歇灭菌；避免沉淀加EDTA培养基灭菌前后对pH调整泡沫中的空气层形成隔热层使菌难杀死，加消泡剂或延长灭菌时间 （二）培养基的分类1.按成分分：天然培养基（complexmedium）LB和麦芽汁培养基等，成本低，实验室和工业使用广合成培养基（syntheticmedium）化学成分了解，如：高氏Ⅰ号和查氏培养基，重复性好、成本高、微生物在上面生长较慢，适于实验室进行营养需要、代谢、分类、菌种选育、遗传分析等 2.根据物理状态分：固体、半固体、液体固体培养基（solidmedium)好的凝固剂：不被利用分解；生长温度范围为固体；凝固点温度不能太低；无毒；灭菌不会破坏；透明及粘着力强；配制方便；便宜；等常用的：琼脂、明胶、硅胶 琼脂是石花菜提取的复杂多糖；明胶是胶原蛋白制备的，但凝固点较低，某些菌产蛋白酶或胶原酶水解明胶，较少用；硅胶硅酸盐被酸中和时凝聚成的胶体，适合自养型。天然固体基质如：马铃薯块、麸皮。固体培养基用途：分离、鉴定、活菌计数、菌种保藏等 斜面 半固体培养基（semisolidmedium)0.2～0.7％琼脂含量用于：运动特征、分类鉴定、噬菌体效价滴定液体培养基（liquidmedium)用于：大规模工业发酵、实验室基础理论和应用方面研究 3.按用途分：基础、加富、鉴别、选择、分析培养基等基础培养基（minimummedium)大多数微生物基本营养要求差不多。基础培养基含一般微生物生长时所需的基本营养物质。 加富培养基（enrichmentmedium)在基础培养基添加特殊营养物质，如：血清、动植物组织液、酵母浸膏等。用于培养苛刻的异养微生物及富集分离某种微生物。与选择培养基区别：加富培养基增加所要分离的微生物量，成为优势菌；选择培养基是抑制不需要的微生物，所需要的为优势菌 鉴别培养基（differentialmedium)加某种化学物质，发生特殊化学反应，产生特征变化，如：明胶培养基鉴别是否产蛋白酶；远藤氏培养基加碱性复红和亚硫酸钠，鉴别水中大肠菌群；H2S用于产H2S菌的鉴别；等 鉴别培养基（differentialmedium） 鉴别培养基（differentialmedium）的应用 选择培养基（selectivemedium)将某种微生物从混合物中分离出，有利于需要菌生长，抑制不需要的微生物。利用微生物对各种化学物质敏感程度的差异,在培养基中加入染料、胆汁酸盐、金属盐类、酸、碱或抗生素中的一种，用以抑制非目的微生物的生长并使所要分离的微生物生长繁殖的培养基。两类：根据某种微生物特殊营养需要设计的类型如：以纤维素唯一碳源分离分解纤维素的菌加某种化学物质，抑制其他微生物生长的类型如：加10％酚抑制细菌、霉菌，分离放线菌；加结晶紫抑制G+，分离G－菌；基因工程菌利用此特点，抗生素抗性筛选重组菌 选择培养基（selectivemedium) （4）其他如：分析培养基（assaymedium)分析某些化学物质的浓度及微生物营养要求；还原培养基（reducedmedium培养厌氧菌；组织培养物培养基（tissue-culturemedium)培养寄生微生物；等 五、营养物质进入微生物细胞的方式（跨膜运输）微生物没有专门的摄食器官或细胞器（原生动物、微型后生动物除外）。各种营养物质需要通过细胞质膜而进入细胞。营养物质各种各样，进入细胞的方式也不尽相同。 高浓到低浓，纯物理过程，不耗能，无载体。影响运输因素：分子小、极性小、温度高、速度快，如：水、乙醇、甘油、一些气体分子、某些aa等。1.扩散(diffusion) 1.扩散(diffusion)亲水分子和憎水分子进出CM情况亲水难以进入，憎水易进入 被动不耗能被运输物质结构不变化不能逆浓度剃度需载体（carrier)，且载体专一性高2.促进扩散（facilitateddiffusion) 物质与载体亲和力在细胞内外不同，使该物质与载体可逆结合分离达到物质运输目的。影响因素：物质细胞内外浓度梯度及载体数量载体蛋白跟酶性质类似，又称透过酶（permease）物质主要是：氨基酸、单糖、维生素、无机盐2.促进扩散（facilitateddiffusion)有时对同一物质运输由一种以上载体完成，如：鼠伤寒沙门氏菌四种载体运输His；酿酒酵母三种载体运输G； 主要物质运输方式。特点：耗能，可逆浓运输能量来源：好氧和兼性直接利用呼吸能；厌氧化学能；光合菌利用光能；嗜盐菌通过紫膜利用光能种类：初级主动运输、次级主动运输、基团转位、Na＋,K＋-ATPase系统、ATP偶联主动运输3.主动运输（activetransport） 3.主动运输（activetransport） 钙离子泵与ATP偶联进行钙离子运输 Na＋,K＋-ATPase系统1957年发现的，利用ATP将Na+由cell内泵出，将K+泵入。3.主动运输（activetransport） 基团转位（grouptranslocation)有复杂的运输系统完成物质运输，物质结构变化。主要存在厌氧和兼性菌，主要用于糖、脂肪酸、核苷、碱基运输。如：E.Coli对G吸收，通过磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）－磷酸糖转移酶运输系统（PTS）将磷酸基团转移到G上，生成磷酸糖释放到CP中。PTS系统由五种蛋白组成，EⅠ、EⅡ（abc三亚基）和HPr4.基团移位 胞饮示意图 胞吞示意图 外排作用示意图 练习题1）微生物由于个体微小一般都是以其群体形式进行研究或利用，这必然就要涉及到对微生物的培养。能否找到一种培养基，使所有的微生物都能良好地生长？为什么？2）试结合微生物学实验课的内容，谈谈在选择、配制和使用培养基时应注意哪些方面的内容。你们在实验中是如何做的？有何体会？3）试比较营养物质进入微生物细胞的几种方式的基本特点 第三节微生物的产能代谢一、产能代谢与生物氧化（呼吸作用）的关系生物氧化的概念:发生在活细胞内的一系列产能性氧化反应的总称。生物氧化（呼吸作用）的本质——氧化还原作用的统一过程。这过程中有能量的产生和转移。微生物的生物氧化有三类：发酵、好氧呼吸和无氧呼吸。无论是哪一种类型，其本质都是氧化还原反应，即在化学反应中一种物质失去电子而被氧化，另一种物质得到电子而被还原，微生物从中获得生命活动需要的能量。 第三节微生物的产能代谢（续）生物氧化还原过程不同于一般的化学氧化还原过程，有以下几个差别：在酶的作用下，常温常压的温和条件；复杂有机物被氧化成二氧化碳、水和其他简单的物质；产生能量供给生物（合成、生命活动、热能）；多步反应，产生许多中间产物；同时吸收和同化各种营养物质。生物能量的转移中心——ATP在微生物的生物氧化过程中，底物的氧化分解产生能量；同时，微生物将能量用于细胞组分的合成。在这两者之间存在能量转移的中心，即ATP。ATP是在发酵、好氧呼吸及无氧呼吸中生成的。微生物（包括各种生物）的能量的产生和转移都是通过ATP进行的。 第三节微生物的产能代谢（续）ATP生成的有三种方式：1．基质(底物)水平磷酸化微生物在基质氧化过程中，产生一种含高自由能的中间体，如发酵中产生含高能健的1，3-二磷酸甘油酸。这一中间体将高能键(~)交给ADP，使ADP磷酸化而生成ATP。2．氧化磷酸化微生物在在氧化底物后产生的电子，通过电子传递体系传递并产生ATP的过程叫氧化磷酸化。3．光合磷酸化光引起叶绿素、菌绿素或菌紫素逐出电子，通过电子传递产生ATP的过程叫光合磷酸化。产氧光合生物包括藻类和蓝细菌，它们依靠叶绿素通过非环式的光合磷酸化合成ATP。不产氧的光合细菌则通过环式光合磷酸化合成ATP。 第三节微生物的产能代谢（续）ATP中的能量，通过与ADP的转换吸收或释放：ADP+Pi→ATP和AMP+2Pi→ATP由反应式可知：ADP是能量的载体，ATP是能量库。ATP含高能磷酸键，它水解释放出高能键，每一个高能键含31.4KJ的能量。ATP只是一种短期的贮能物质。若要长期贮能，还需转换形式。如果有过剩的ATP，大多数微生物会将其能量转化到储能物中去，如PHB(聚β-烃基丁酸)、异染粒、淀粉、肝糖、糖原及硫粒等，以备缺乏营养和能源时用。 第三节微生物的产能代谢（续）二、生物氧化的类型在微生物体系中，能量的释放、ATP的生成都是通过生物氧化实现的。根据最终电子受体（或最终受氢体），可划分为3种类型：发酵--以分解过程中的中间代谢产物(低分子有机物)为最终电子受体好氧呼吸--以O2为最终电子受体无氧呼吸--以除O2外的无机化合物，如NO2-、NO3-、SO42-、CO32-及CO2等作为最终电子受体 第三节微生物的产能代谢（续）1．发酵在无外在电子受体时，微生物氧化一些有机物。有机物仅发生部分氧化，以它的中间代谢产物(即分子内的低分子有机物)为最终电子受体，释放少量能量，其余的能量保留在最终产物中。以葡萄糖的酵解为例，葡萄糖的逐步分解称糖酵解(即EMP途径或E-M途径)。糖酵解几乎是所有具有细胞结构的生物所共有的主要代谢途径。以葡萄糖的乙醇发酵为例，可分为两大步：（1）不涉及氧化还原反应的预备性反应：葡萄糖（C6H12O6）→→→3-磷酸甘油醛；（2）有氧化还原的反应：→→丙酮酸（CH3COCOOH）→乙醛（CH3CHO）（二氧化碳）→乙醇（CH3CH2OH）。通过底物磷酸化，得到ATP。1mol的葡萄糖，可以得到2mol的ATP、2mol的乙醇和2mol的二氧化碳。（图） 第三节微生物的产能代谢（续）从丙酮酸开始，通过各种微生物不同的发酵作用，产生各种不同的产物。如：混合酸发酵、丁二醇发酵、丙酸发酵等等。 第三节微生物的产能代谢（续）表不同的发酵类型及其有关微生物发酵类型产物微生物乙醇发酵乙醇、CO2酵母菌属（Saccharomyces）乳酸同型发酵乳酸乳酸细菌属（Lactobacillus）乳酸异型发酵乳酸、乙醇、乙酸、CO2明串球菌属（Leuconostoc）混合酸发酵乳酸、乙酸、乙醇、甲酸大肠埃希氏杆菌、CO2、H2（Escherichiacoli）丁二醇发酵丁二醇、乳酸、乙酸、乙醇、气杆菌属CO2、H2（Aerobacter）丁酸发酵丁酸、乙酸、CO2、H2丁酸梭菌(Clostridiumbutylicum)丙酮-丁醇发酵丁醇、丙酮、乙醇丙酮丁醇梭菌属（Clostridium）丙酸发酵丙酸丙酸杆菌属（Propionibacterium） 第三节微生物的产能代谢（续）2．好氧呼吸在分子氧存在的条件下，以O2为最终电子受体，底物被全部氧化成CO2和H2O，并产生ATP。底物氧化释放的电子首先转移给NAD，使之成为NADH2，然后再转移给电子传递体系，最终到达分子氧O2。好氧呼吸能否进行，取决于O2的体积分数能否达到0.2%（为大气中O2的体积分数21%的1%）。O2的体积分数低于0.2%，好氧呼吸不能发生。 第三节微生物的产能代谢（续）以葡萄糖为例，葡萄糖的氧化分解分两阶段：（1）经EMP途径，形成中间产物——丙酮酸。C6H12O6→→→2CH3COCOOH。产生2NADH2和4ATP，并消耗2ATP。此步同在发酵中的过程。（2）丙酮酸的有氧分解，经过三羧酸（TCA）循环得到分解。丙酮酸→乙酰辅酶A和1mol的NADH2，然后进入TCA循环，被彻底氧化分解，产生NADH2和CO2等。 第三节微生物的产能代谢（续）呼吸链：有氧呼吸中传递电子的一系列偶联反应，由NAD或NADP、FAD或FMN、辅酶Q、细胞色素等组成。其功能是传递电子和产生ATP。其在细胞中的位置：真核细胞是线粒体，原核细胞是细胞质膜。在好氧呼吸中，由前面EMP和TCA产生的H（NADH2和FADH2），通过电子传递体系（呼吸链），最终到达分子氧，形成水。在这一传递过程中，产生ATP。（称为氧化磷酸化） 电子传递体系（呼吸链） 电子传递体系的电位和ATP的产生 第三节微生物的产能代谢（续）能量的平衡：1份葡萄糖，转化成2丙酮酸时，产生2NADH2和4ATP（底物磷酸化），并消耗2ATP；1mol的丙酮酸经TCA循环，生成4molNADH2、1molFADH2(黄素腺嘌呤二核苷酸)、1molGTP(鸟嘌呤三核苷酸，，随后转化成1mol的ATP)。通过呼吸链，1molNADH2产生3mol的ATP，1molFADH2产生2mol的ATP。最后得到的能量：（4×3+1×2+1）×2+2×3+4-2=38（mol）ATP。释放的总能量约2876KJ，能量利用效率为31.4×38/2876=42%。其余的能量变成热能耗散。这个效率是高的，所以好氧呼吸氧化彻底，能量利用效率高。总反应过程：C6H12O6+6O2→6CO2+6H2O+38ATP 第三节微生物的产能代谢（续）3．无氧呼吸(分子外的无氧呼吸)在电子传递体系中，氧化NADH2时的最终电子受体不是氧气，而是除O2外的无机化合物，如NO2-、NO3-、SO42-、CO32-及CO2等。无氧呼吸的氧化底物一般为有机物，如葡萄糖、乙酸和乳酸等，它们被氧化为CO2，有ATP产生。例如，以NO3-为最终电子受体的情况：C6H12O6+6H2O→6CO2+24H24H+4NO3-→12H2O+2N2总反应：C6H12O6+4NO3-→6CO2+2N2+6H2O+能量释放总能量为1756KJ,得到2ATP。上述过程被称为反硝化作用，或硝酸盐还原作用。 第三节微生物的产能代谢（续）以其他无机氧化物为最终电子受体的情况：以SO42-为最终电子受体如：2CH3CHOHCOOH+H2SO4----2CH3COOH+2CO2+H2S+2H2O+1125kJ以CO2和CO为最终电子受体如：2CH3CH2OH+CO2----CH4+2CH3COOH4H2+CO2----CH4+2H2O3H2+CO----CH4+H2O 第三节微生物的产能代谢（续）三、微生物的发光现象发光细菌含两种特殊的成分：虫荧光素酶和长链脂肪族醛。发光过程（见图）发光细菌被应用在环境监测及其他领域。 第四节微生物的合成代谢一、产甲烷菌的合成代谢产甲烷菌利用C1和C2有机物产生CO2和CH4，利用其中间代谢产物和能量物质ATP合成蛋白质、多糖、脂肪和核酸等物质，用以构成自身的细胞。如：嗜热乙酸梭菌同化CO2合成乙酸（见图）产甲烷菌同化CO2（逆三羧酸循环途径）（见图） 第四节微生物的合成代谢（续）二、化能自养型微生物的合成代谢各种化能自养型微生物的合成代谢的合成途径不同，如硫氧化细菌的合成代谢为：H2S+2O2→SO42-+2H+795KJCO2+4H→[CH2O]+H2O其余的见教材。 第四节微生物的合成代谢（续）三、光合作用1．藻类的光合作用（同绿色植物）白天，在有光的条件下，利用体内的色素（叶绿素、类胡萝卜素、藻蓝素、藻红素等），从H2O的光解中获得H2，还原CO2成[CH2O]。总反应式为：CO2+H2O→[CH2O]+O2 第四节微生物的合成代谢（续）2．细菌的光合作用细菌光合作用的供氢体为H2S和H2。因光合细菌种类不同，其光合反应也有所不同。有三种生化反应：（1）绿硫细菌属CO2+2H2S→[CH2O]+2S+H2O（2）红硫细菌科2CO2+H2S+2H2O→2[CH2O]+H2SO4（3）氢单胞菌属CO2+2H2→[CH2O]+H2O光合细菌通过光周期把CO2固定，并转变为高能贮存物——聚β羟基丁酸（PHB）。CO2固定的途径为卡尔文循环，详见图。 第四节微生物的合成代谢（续）3．有机光合细菌的光合作用以光为能源，以有机物为供氢体还原CO2，合成有机物。有机酸和醇是它们的供氢体和碳源。例如，红螺菌科的细菌能利用异丙醇作供氢体进行光合作用，并积累丙酮。(CH3)2CHOH+CO2→2CH3COCH3+[CH2O]+H2O4．藻类光合作用与细菌光合作用的比较详见下表 藻类光合作用与细菌光合作用的比较 第四节微生物的合成代谢（续）四、异养微生物的合成代谢异养微生物利用现成的有机物作碳源和能源，用分解过程中的中间代谢产物和分解代谢中得到的ATP合成自身细胞的组成成分。 双歧发酵利用HK途径乙酰磷酸乙酸GF-6-P己糖解酮酶4-磷酸赤藓糖F-6-P5－P-木酮糖＋5-P-核糖3－P－甘油醛乳酸乙酰磷酸磷酸戊糖解酮酶乙酸如：两歧双歧杆菌细菌有的还可以进行丙酸发酵；丁酸发酵；丙酮－丁醇发酵；混合酸发酵等如：产气肠杆菌和大肠杆菌通过V.P.试验，前者产生乙酰甲基甲醇有胍基产生红色（阳性）。 '