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'微生物实验课件 目录实验一培养基的配置、分装和灭菌实验二环境中微生物的检测和菌落识别实验三微生物的纯种分离实验四细菌染色法和光学显微镜的使用实验五微生物的间接计数法——水中细菌总数的测定实验六放线菌和真菌的培养和形态观察实验七微生物显微镜直接计数法实验八细菌芽孢染色法实验九微生物生长量的测定和生长曲线的绘制实验十物理、化学因素对微生物生长的影响实验十一细菌鉴定中的生理生化反应实验十二食用菌菌种的分离和制种技术实验十三环境中细菌分离鉴定综合实验Herecomesyourfooter2 实验一培养基的配置、分装与灭菌实验方法高压蒸汽灭菌，121℃灭菌20分钟Herecomesyourfooter9 实验一培养基的配置、分装与灭菌注意事项称取药品时严防药品混杂，一把牛角匙称一种药品；蛋白胨极易吸湿，称取动作要迅速；配制固体培养基时，先将其他药品加热溶解到快沸时，再将称好的琼脂加入，继续加热至琼脂完全熔化，要求不断搅拌，以免糊底，并防止沸腾外溢；分装量根据试管大小和实际需要而定，固体培养基装量约为管高的1/5，液体培养基约为管高的1/4，三角瓶不超过瓶体的1/2；分装时不要将培养基沾在管（瓶）口上，以免引起污染。Herecomesyourfooter10 实验一培养基的配置、分装与灭菌思考题1.思考牛肉膏蛋白胨培养基属于何种培养基？2.为什么湿热灭菌比干热灭菌法更有效？Herecomesyourfooter11 实验二环境中微生物的监测与菌落识别实验目的实验原理实验器材实验方法实验结果注意事项思考题Herecomesyourfooter12 实验二环境中微生物的监测与菌落识别实验目的掌握各种微生物接种的基本操作技术；初步了解周围环境中微生物的分布状况；熟悉四大类微生物菌落的形态特征。Herecomesyourfooter13 实验二环境中微生物的监测与菌落识别实验原理在我们周围环境中存在着种类繁多、数量庞大的微生物，他们很小，人们用肉眼看不到，将他们在一定的温度下培养一段时间，可繁殖成一个个肉眼可见的细胞群体，就可以进行鉴别。接种是指在无菌操作条件下，将某种微生物的纯种移接到适合微生物其生长的新鲜培养基中或生物体内的一种操作过程。实验室常用的接种方法有斜面接种、穿刺接种、三点接种和液体接种。Herecomesyourfooter14 实验二环境中微生物的监测与菌落识别实验器材菌种：实验室环境微生物、大肠杆菌、酿酒酵母、放线菌及霉菌。培养基：马铃薯固体培养基、牛肉膏蛋白胨固体培养基、高氏一号固体培养基其他：无菌培养皿、无菌棉签、火柴、超净工作台及恒温培养箱。Herecomesyourfooter15 实验二环境中微生物的监测与菌落识别实验方法斜面接种Herecomesyourfooter16 实验二环境中微生物的监测与菌落识别实验方法液体接种斜面液体培养基接种环将接种环送入液体培养基中时使环在液体与管壁接触的地方轻轻磨擦，使菌体分散，然后塞上棉塞，再轻轻摇动均匀，即可培养。如果菌种是培养在液体培养基中时，一般用移液管或滴管接种。Herecomesyourfooter17 实验二环境中微生物的监测与菌落识别实验方法穿刺接种用接种针挑取菌种后，插入固体培养基内（不要刺到底部），再沿原路拔出。此法用于厌气性细菌接种、检查细菌的运动能力。Herecomesyourfooter18 实验二环境中微生物的监测与菌落识别实验方法平板接种（1）斜面接平板a.划线法：见平板划线分离法。b.点种法：常用于观察霉菌和酵母细胞，轻点在平板的表面（根霉点一点，曲霉、酵母可点3-4点）。（2）平板接斜面一般是将经平板分散培养得到的单菌落接种到斜面，以便作鉴定或扩大培养、保存之用。Herecomesyourfooter19 实验二环境中微生物的监测与菌落识别实验结果环境中微生物放线菌酵母细菌霉菌Herecomesyourfooter20 实验二环境中微生物的监测与菌落识别注意事项用于倒平板的培养基一定要彻底融化，否则会在所倒的平板培养基表面出现为融化的琼脂快。而且，倒平板时的培养基温度不能过高（50~60℃为宜），否则会在皿盖内侧形成较多的冷凝水或在凝固的平板表面形成许多冷凝水微滴，不利于单菌落的形成。在无菌操作到平板的过程中，切忌用手抓、握三角瓶的瓶口处，以防灼热的瓶口端烫伤手指。同时，手指上的微生物也会污染瓶的口端，造成严重的操作污染等。Herecomesyourfooter21 实验二环境中微生物的监测与菌落识别思考题1。在高倍镜或油镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝?2。酵母菌的假菌丝是怎样形成的?与霉菌的真菌丝有何区别?Herecomesyourfooter22 实验三微生物的纯种分离法实验目的实验原理实验器材实验方法实验结果注意事项思考题Herecomesyourfooter23 了解平板划线法分离菌种的基本原理及操作；了解用浇注平板法和涂布平板法分离微生物纯种的原理及操作。实验三微生物的纯种分离法实验目的Herecomesyourfooter24 实验三微生物的纯种分离法实验原理自然界中，绝大多数微生物都是混杂生活在一起的；必须从混杂的微生物类群中分离以得到只含有这一种微生物的纯培养物，这种获得纯培养物的方法称为微生物的分离与纯化。一般根据该微生物营养、培养特点、对某种抑制剂的耐受性不同及对某种环境条件要求不同，制作或设置一些选择性培养基及选择性培养条件，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或划线法分离，纯化该微生物，直至得到该纯种菌株。Herecomesyourfooter25 实验三微生物的纯种分离法实验器材样品：土样培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基、豆芽汁培养基。其它：盛9mL无菌水的试管、盛90mL无菌水并带有玻璃珠的三角瓶、无菌玻璃涂棒、无菌吸管、接种环、无菌培养皿。Herecomesyourfooter26 实验三微生物的纯种分离法实验方法稀释平板法图14-1从土壤中分离微生物操作过程Herecomesyourfooter27 实验三微生物的纯种分离法实验方法平板划线分离法交叉划线法连续划线法Herecomesyourfooter28 实验三微生物的纯种分离法实验结果Herecomesyourfooter29 实验三微生物的纯种分离法注意事项用于划线的接种环，环柄宜长些（约10cm），环口应十分圆滑，划线时环口与平板间的夹角应小些，动作要轻巧，以防划破平板。用于平板划线的培养基，琼脂含量宜高些（2%左右），否则会因平板太软而被划破。平板不能倒的太薄，最好在使用前一天倒好。为防平板表面产生冷凝水，倒平板前培养基温度不能太高。Herecomesyourfooter30 实验三微生物的纯种分离法思考题1.在你所实验的三种培养基平板上长出的菌落属于哪个类群？简述它们的菌落形态特征。2.稀释分离时，为什么要将融化的琼脂培养基冷却到45～50℃左右才能倾入装有菌液的培养皿内？3.划线分离时，为什么每次都要将接种环上多余的菌体烧掉？划线为何不能重叠？4.培养时为什么要将培养皿倒置培养？Herecomesyourfooter31 实验四细菌的染色法和光学显微镜的使用实验目的实验原理实验器材实验方法实验结果注意事项思考题Herecomesyourfooter32 实验四细菌的染色法和光学显微镜的使用实验目的学习和掌握显微镜油镜的正确使用；学习细菌制片和单染色技术；观察细菌的三种基本形态；学习细菌的革兰氏染色原理和方法。Herecomesyourfooter33 实验四细菌的染色法和光学显微镜的使用实验原理1.油镜物镜的工作原理使用油质作为玻片与接物镜之间的介质——油浸系可以增加显微镜的放大倍数可以增加视野的照明度可以增大显微镜的分辨率Herecomesyourfooter34 实验四细菌的染色法和光学显微镜的使用实验原理油镜头的识别和重要参数放大倍数数值口径工作距离Herecomesyourfooter35 实验四细菌的染色法和光学显微镜的使用实验原理2.革兰氏染色原理G-菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结果细菌就被脱色，再经复红复染后就成红色。G+菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小，通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。Herecomesyourfooter36 实验四细菌的染色法和光学显微镜的使用实验器材活材料：培养24小时的大肠杆菌金黄色葡萄球菌。染色液和试剂：结晶紫、碘液、95%酒精、石炭酸复红、蒸馏水、香柏油。器材：载玻片、接种杯、酒精灯、擦镜纸、显微镜。Herecomesyourfooter37 实验四细菌的染色法和光学显微镜的使用实验方法1.革兰氏染色（1）涂片（2）晾干（3）固定（4）结晶紫染色：加适量（以盖满细菌涂面）的结晶紫染色液染色1min；水洗：倾去染色液，用水小心地冲洗。（5）媒染：碘液，媒染1min；水洗：用水洗去碘液。（6）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱色15~20s至流出液无色，立即水洗。（7）复染：滴加复红复染1min；水洗：用水洗去涂片上的复红染色液。（8）晾干：将染好的涂片用吸水纸吸干。（9）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色结果。Herecomesyourfooter38 实验四细菌的染色法和光学显微镜的使用实验方法2.油镜的使用方法（1）用低倍镜对光。最大光圈（2）低倍镜观察（寻找观察目标）。适当缩小光圈（3）高倍镜观察（选取理想的观察目标）。（4）油镜观察：高倍镜观察后-上升镜筒-油镜转至正下方，在载玻片上加一小滴油-小心地下降镜筒使镜头浸在油里-用粗螺旋将镜筒慢上升，寻找目标（物象）用细螺旋调节，使物象清晰-观察记录。最大光圈Herecomesyourfooter39 实验四细菌的染色法和光学显微镜的使用实验结果革兰氏阳性球菌革兰氏阴性杆菌Herecomesyourfooter40 实验四细菌的染色法和光学显微镜的使用注意事项观察完毕，上升镜筒，转动油镜物镜偏位。用干净擦镜纸擦去镜头上的油迹，再取用二甲苯擦去镜头上残留的香柏油，最后再用一张干净的擦镜纸擦去残留在镜头上的二甲苯。革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。脱色过度，革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；脱色时间过短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间还受涂片厚薄及乙醇用量等因素影响。染色过程中勿使染色液干涸。水冲洗后，吸去玻片上的残水，以免影响染色效果。选用幼龄的细菌。菌龄太老、死亡或自溶常使革兰氏阳性菌转呈阴性反应。Herecomesyourfooter41 实验四细菌的染色法和光学显微镜的使用思考题你认为那些环节会影响革兰氏染色结果的正确性？其中最关键的环节是什么？如何使你的染色结果可信？Herecomesyourfooter42 实验五微生物的间接计数法——水中细菌总数的测定实验目的实验原理实验器材实验方法实验结果注意事项思考题Herecomesyourfooter43 实验五微生物的间接计数法——水中细菌总数的测定实验目的了解并掌握细菌总数的测定方法了解大肠菌群数量与水质状况的关系Herecomesyourfooter44 实验五微生物的间接计数法——水中细菌总数的测定实验原理饮用水是否合乎标准，通常通过水中细菌总数和大肠菌群数来确定。细菌总数是指1毫升水样在普通琼脂培养基中，37℃24小时培养后所生长的菌落数。一般规定，1毫升自来水的总菌数不得超过100个。Herecomesyourfooter45 实验五微生物的间接计数法——水中细菌总数的测定实验器材普通琼脂培养基；无菌空瓶；灭菌水；灭菌培养皿、吸管、试管；自来水、池水、河水或湖水。Herecomesyourfooter46 实验五微生物的间接计数法——水中细菌总数的测定实验方法1．水样的采取自来水：先将自来水龙头用火焰烧灼3min灭菌，再开放水龙头使水流5min后，以灭菌三角烧瓶接取水样，以待分析。池水、河水或湖水：应取距水面10~15cm的深层水样，先将灭菌的带塞玻璃瓶，瓶口向下浸人水中，然后翻转过来，除去玻璃塞，水即流人瓶中，盛满后，将瓶塞盖好，再从水中取出，最好立即检查，否则需放入冰箱中保存。Herecomesyourfooter47 1:10稀释液225mL无菌水1mL1mL9mL稀释液1:1009mL稀释液1:10001mL1mL1mL1mL1mL1mL无菌水25g或25ml检样2.稀释样品的取样和倾注平皿每个稀释度做两个平皿倾注平皿将凉至46℃营养琼脂培养基注入平皿约15mL，并转动平皿，混合均匀。操作要求：无菌操作Herecomesyourfooter48 实验五微生物的间接计数法——水中细菌总数的测定实验方法培养及计数培养条件：倒置于36±1℃温箱内培养48±2h菌落计数：以30~300为界，具体情况具体分析（详见P320）规律：不同稀释度的菌落数应与稀释倍数成反比（同一稀释度的二个平板的菌落数应基本接近），即稀释倍数愈高菌落数愈少，稀释倍数愈低菌落数愈多。如出现逆反现象，则应视为检验中的差错不应作为检样计数报告的依据。Herecomesyourfooter49 实验五微生物的间接计数法——水中细菌总数的测定实验结果计算水中总细菌数量Herecomesyourfooter50 实验五微生物的间接计数法——水中细菌总数的测定注意事项水样采集后，应速送回实验室测定，若来不及测定应放在4℃冰箱存放，若无低温保藏条件，应在报告中注明水样采集和测定的间隔时间。一般较清洁的水可在12h内测定，污水须在6h内结束测定。Herecomesyourfooter51 实验五微生物的间接计数法——水中细菌总数的测定思考题1。通过对自来水样品中细菌总数的测定，你认为此样品是否符合国家饮用水的卫生标准？2。你所检测的水源的水污染情况如何？Herecomesyourfooter52 实验六放线菌和真菌的培养和形态观察实验目的实验原理实验器材实验方法实验结果注意事项思考题Herecomesyourfooter53 实验六放线菌和真菌的培养和形态观察实验目的学会用插片法培养放线菌的制片方法。掌握用显微镜观察放线菌个体形态特征的方法。学会与掌握霉菌的三点接种法。掌握用显微镜观察青霉的形态特征。Herecomesyourfooter54 实验六放线菌和真菌的培养和形态观察实验原理放线菌的形态特征是菌种选育和分类的重要依据放线菌的菌丝体由基内菌丝、气生菌丝和孢子丝组成放线菌的菌丝体可沿着培养基与盖玻片的交界线蔓延生长，易黏附在盖玻片上，从而获得直观标本——插片法Herecomesyourfooter55 实验六放线菌和真菌的培养和形态观察实验原理Herecomesyourfooter56 实验六放线菌和真菌的培养和形态观察实验原理插片法：Herecomesyourfooter57 实验六放线菌和真菌的培养和形态观察实验原理三点接种法的优点在同皿中获得3个重复的菌落；在三个彼此相邻的菌落间形成一些菌丝体稀疏且较透明的狭窄区域，该区域的气生菌丝仅分化出少数子实体，故能在低倍镜下观察到菌丝的自然着生状态和子实体的形态特征Herecomesyourfooter58 实验六放线菌和真菌的培养和形态观察实验原理三点接种：青霉的菌落Herecomesyourfooter59 实验六放线菌和真菌的培养和形态观察实验器材1.菌种：链霉菌，青霉2.培养基：高氏一号琼脂培养基3.器皿：培养皿，盖玻片，载玻片，显微镜等Herecomesyourfooter60 实验六放线菌和真菌的培养和形态观察实验方法放线菌的培养与观察：倒平板：每皿约20mL培养基先插片后接种：接种线长盖玻片的一半，在盖玻片两端留有空白培养：28℃，3~7d镜检：在载玻片上滴一滴水，有菌丝的一面朝上，低高倍镜观察可省略镜检时先擦去盖玻片一面菌丝体的操作注意分界面两侧菌丝体的形态差异Herecomesyourfooter61 实验六放线菌和真菌的培养和形态观察实验方法霉菌的培养与观察：倒平板：每皿约15mL培养基三点接种培养：28℃，3~7d镜检：做水片，低高倍镜观察尽量避免挑断菌丝，可适当挑取培养基“挖”Herecomesyourfooter62 实验六放线菌和真菌的培养和形态观察注意事项镜检时特别注意放线菌的基内菌丝、气生菌丝的粗细和色泽差异。放线菌的生长速度较慢，培养周期较长，在操作中应特别注意无菌操作，严防杂菌污染。若将培养后的盖玻片用0.1%美蓝液染色后再做镜检，则效果更好。Herecomesyourfooter63 实验六放线菌和真菌的培养和形态观察实验结果在高倍镜下寻找放线菌的基内菌丝、气生菌丝及孢子丝在低倍镜下寻找霉菌的整个形态特征在高倍镜下详细观察霉菌的分生孢子、小梗、分生孢子梗等Herecomesyourfooter64 实验六放线菌和真菌的培养和形态观察实验结果分生孢子小梗梗基分生孢子梗青霉Herecomesyourfooter65 实验六放线菌和真菌的培养和形态观察思考题1.在显微镜的高倍镜下如何区分放线菌的基内菌丝和气生菌丝？2.用插片法制备放线菌的标本，其主要优点是什么？可否用此法培养与观察其他几类微生物，应作哪些改进，为什么？Herecomesyourfooter66 实验目的实验原理实验器材实验方法实验结果注意事项思考题实验七微生物显微镜直接计数法Herecomesyourfooter67 实验七微生物显微镜直接计数法实验目的了解显微镜计数的原理；学习并掌握使用血球计数板进行微生物直接计数的方法。Herecomesyourfooter68 实验七微生物显微镜直接计数法实验原理利用血球计数板在显微镜下直接计数，是微生物实验中一种十分重要的常用微生物计数方法。此法的优点是直观、快速，不论微生物的生理状况如何，都可以在显微镜下一一计数。由于此法得到的是活菌和死菌的总和，故又称为总计数法。Herecomesyourfooter69 实验七微生物显微镜直接计数法实验原理血球计数板是一块特制的载玻片，其上四条纵槽构成了三个平台，中间的平台又被一短横槽隔成两半，每一边的平台上各刻有一个方格网，每个方格网共分成9个大方格，中央的大方格为计数室。计数室边长1mm，共有400个小方格，加盖玻片于突起部分上时，即形成一个体积为0.1mm3的计数室。计数室的规格有两种：一种是25个中方格×16个小格，另一种是16个中方格×25个小格，所以小方格的总数是相同的，都为400个。Herecomesyourfooter70 Herecomesyourfooter71 实验七微生物显微镜直接计数法实验原理本实验通过用美蓝染色浸片来观察生活的酵母形态和出芽生殖方式。美蓝是一种无毒性染料，它的氧化型是蓝色的，而还原型是无色的，用它来对酵母的活细胞进行染色。美蓝（氧化型）蓝色还原剂氧化剂美蓝（还原型）无色Herecomesyourfooter72 实验七微生物显微镜直接计数法实验原理死活细胞鉴定原理酵母活细胞新陈代谢还原能力美蓝（氧化型）蓝色美蓝（还原型）无色Herecomesyourfooter73 实验七微生物显微镜直接计数法实验器材菌种：酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）培养约2d的麦芽汁斜面培养物；染色液和试剂：0.05％和0.1%吕氏碱性美蓝染液；器材：废液缸、载玻片、盖玻片、酒精灯、擦镜纸、显微镜等。Herecomesyourfooter74 实验七微生物显微镜直接计数法实验方法稀释镜检计数室（用酒精棉擦拭）加样品（盖上盖玻片，无菌的细口滴管由盖玻片边缘滴一小滴）显微镜计数清洗血球计数板（冲洗，晾干）Herecomesyourfooter75 实验七微生物显微镜直接计数法实验结果将显微计数结果记录于下表中。T表示五个中方格中的总菌数；D表示菌液稀释倍数各中格中菌数TD二室平均值个/ml12345第一室第二室Herecomesyourfooter76 实验七微生物显微镜直接计数法注意事项加样时先摇匀菌液，计数室中不可有气泡产生；计数时，格线上的菌体只数上方和右边线上的；如遇酵母出芽，芽体大小达到母细胞的一半时，作为两个菌体计算；清洗计数板时切勿用手或硬物刷洗。Herecomesyourfooter77 实验七微生物显微镜直接计数法思考题在显微镜下直接测定微生物数量有什么优缺点？滴加样品时计数室内易产生气泡的原因是什么？如何避免Herecomesyourfooter78 '