徐阳本科论文答辩PPT.ppt 17页

'吉林大学本科生毕业答辩答辩题目：人参β-香树素合成酶的同源模建及高通量虚拟筛选抑制剂的研究HomologyModelingandHigh-throughoutScreeningwithComputerofaNewInhibitorofPanaxβ-AS答辩人：07级生物技术徐阳指导老师：韩葳葳副教授 内容提要前言同源模建建立β-AS三维结构分子动力学模拟优化所建立的三维结构抑制剂的结合位点的预测高通量虚拟筛选 前言人参皂苷简介人参皂苷是人参的主要活性成分，至今已经发现四十余种人参皂苷。人参皂苷具有抗炎、抗氧化作用，还有广泛的抗肿瘤作用。目前，人参皂苷已成为医药、食品、轻工等行业的重要原料，随着对人参皂苷生理活性研究的深入和中药现代化的要求，对人参皂苷的需求量将会进一步上升。 提高人参皂苷产量的途径——寻找人参β-香树素合成酶（β-AS）的高效抑制剂经过对人参皂苷生物代谢途径的研究发现，2,3—氧化鲨烯的环化是植物固醇代谢途径与人参皂苷代谢途径的分支点。经过β-AS的催化，最终产生了植物固醇。所以，如果能寻找到β-AS的高效抑制剂，有效的抑制其活性，则能引导代谢流向人参皂苷合成途径，可以提高人参皂苷的产量。 同源模建β-AS蛋白的序列已经得知，于是我们将其序列提交到Swiss—model的自动比较蛋白质模建服务器上，经程序自动选择，选择了在甾族化合物骨架形成中起重要作用的人的氧化鲨烯环化酶，并且以序列相似性为41％的晶体结构1W6J为模板[2]，直接生成了β-AS的初始三维结构。 分子动力学模拟在2.2ns的MD模拟过程中RMSD随时间变化曲线我们在初始的三维结构基础上，利用GROMACS程序对其进行了分子动力学2.2ns(MD)模拟。由图可以看出，β-AS体系的RMSD在2ns之后趋于不变（0.35），体系已经稳定。最终得到的β-AS的三维结构 a为β-AS的最终结构，b为其表面能量。 验证三维结构的可靠性右图显示了β-AS结构中QMEANZ-scores。QMEANZ-scores表示蛋白稳定性的预测。经过分子动力学模拟之后，Z-scores的值为-6.16，说明β-AS结构稳定。 右图显示的是Profiles-3D的分值。经过分子动力学优化后，各残基的兼容性均有所提高。而对于最终的结构β-AS，其所有残基的得分均大于0，这说明所有的残基都处于合理的位置。综上，经过两种不同的评估方法验证，说明β-AS的结构是可靠的。 10-aza-10,11-dihydro-2,3-oxidosqualene是与底物2,3-oxidosqualene竞争型的抑制剂，因此抑制剂的结合位点是底物的结合位点。秦玉芝等人认为在甾醇生物合成中的关键酶（包括β-AS）的氨基酸序列中存在极度保守的部分（例如Leu252，Leu285），此外，目前没有任何其它信息提供活性口袋所处的位置以及组成。通过Binding-site模块搜寻活性口袋，搜寻到一处包含有Leu252，Leu285的位点，可以确定为活性部位。抑制剂结合位点的预测 高通量虚拟筛选我们以10-aza-10,11-dihydro-2,3-oxidosqualene作为先导化合物通过建立的筛选策略进行筛选，从ZINC数据库的1300多万小分子中筛选出来的120个小分子中，使用AutoDockvina对120个小分子分别与β-AS进行分子对接。选择能量最低的小分子（化合物8442257）做进一步的深入研究。 a为抑制剂10-aza-10,11-dihydro-2,3-oxidosqualene的结构；b为复合物8442257；c为β-AS与复合物8442257的分子对接模型；d为β-AS活性位点处的一些残基与8442257之间的氢键。 将8442257和10-aza-10,11-dihydro-2,3-oxidosqualene放在活性位点中。用Gaussian03AM1方法对其优化结构，然后用Affinity软件对接。LigandEvdw(KJmol-1)Eele(KJmol-1)Etotal(KJmol-1)LudiScore8442257-73.10-2.59-75.6980210-aza-10,11-dihydro-2,3-oxidosqualene-64.60-0.40-64.26621Table1ThetotalenergyEtotal,van-der-WaalenergyEvdwandelectrostaticEelebetweeninhibitorsandβ-ASLudiScore从上表中看到，化合物8442257与酶相互作用时候，相互作用能比较低，而Ludi得分比较高，说明8442257是比10-aza-10,11-dihydro-2,3-oxidosqualene好的抑制剂。 8442257与β-AS酶活性口袋中的部分残基共形成2个氢键，从而提高了抑制剂的稳定性．8442257与Ser413的羧基部分形成1个氢键，Trp613与8442257形成了1个氢键，所以Ser413和Trp613在抑制剂8442257的识别起到极为重要的作用。因此它们在β-AS中起到稳定抑制剂的作用。分子间的非键相互作用对于确定抑制剂与酶之间的相对位置以及关键残基非常重要，由于β-AS的活性口袋较大，涉及氨基酸残基非常多，与8442257活性位点残基之间的总相互作用能小于-1kJ/mol的残基及其相互作用能列在下表表中。 ResiduesEvdw(KJmol-1)Eele(KJmol-1)Etotal(KJmol-1)Leu287-9.81-1.16-10.97Pro194-5.88-0.43-6.31Leu285-6.060.08-.7.39Trp6130.10-5.69-5.59Gln288-5.45-0.07-5.52Ser413-0.09-5.28-5.37Tyr184-5.090.14-4.94Glu291-4.19-0.12-4.51Arg206-3.170.31-2.86Glu290-3.67-0.01-3.68Tyr292-2.11-0.23-3.34Ile188-2.330.55-1.78Met185-1.47-0.00-1.47Cys202-0.72-0.28-1.00ThetotalenergyEtotal,van-der-WaalenergyEvdwandelectrostaticEelebetween8442257andindividualresiduesofβ-AS 综上所述，从氢键和相互作用能两个方面来看，Leu287Pro194,Leu285,Trp613,Gln288,Ser413,Tyr184,Glu291Arg206,Glu290,Tyr292,Ile188,Met185,Cys202这14个氨基酸残基在β-AS中，对抑制剂8442257都具有重要的作用。我们的研究设计β-AS酶专有的抑制剂提供可靠的理论线索。 谢谢！'