最新三-谷氨酸生产菌与扩大培养课件PPT.ppt 91页

'三-谷氨酸生产菌与扩大培养 教学内容1，了解谷氨酸生产菌的主要特征、特点。2，掌握菌种的扩大培养方法。3，了解影响生产菌生长的主要因素。 教学目的与要求学时：4 前言：3，采用遗传工程新技术选育谷氨酸优良菌种 前言：二，谷氨酸生产菌保存方法1，几种斜面培养基保存方法 前言：二，谷氨酸生产菌保存方法2．磷酸盐缓冲液保存方法的改进 前言：二，谷氨酸生产菌保存方法3．试管熔封法保存谷氨酸菌种的研究 前言：二，谷氨酸生产菌保存方法4．液氮超低温保存谷氨酸菌种 第一节谷氨酸生产菌的主要特征和菌学性质一，现有谷氨酸生产菌的分类：现有谷氨酸生产菌主要是棒状杆菌属、短杆菌属、小杆菌属及节杆菌属中的细菌。这四个属在细菌的分类系统中彼此比较接近。短杆菌属隶属于短杆菌科(Brevibacteriaceace)，而棒状杆菌属、小杆菌属及节杆菌属则都隶属于棒状杆菌科(corynebacteriaceae)。短杆菌科和棒状杆菌科均属于真细菌目中的革兰氏染色阳性、无芽抱杆菌及有芽抱杆菌的一大类。 二，现有谷氨酸生产菌的菌学性质： 三，现有谷氨酸生产菌的主要特征： 三，现有谷氨酸生产菌的主要特征： 三、现有谷氨酸生产菌的主要特征（总结） 第二节谷氨酸生产菌在发酵过程中的形态变化人们发现，谷氨酸生产菌在发酵过程中会发生明显的菌体形态的变化。实践证明，在发酵过程中发现菌体形态有明显的变化时，正是产谷氨酸的激增时间。但在发酵培养基含有过剩生物素的培养条件下，菌体形态则没有明显变化，却呈现耗糖、长菌、不产谷氨酸的异常发酵。 一、种子的菌体形态斜面和一、二级种子培养在不同培养条件下,细胞形态基本相似。斜面培养的菌体较细小,一、二级种子比斜面菌体大而粗壮，革兰氏染色深。多为短杆至棒杆状，有的微呈弯曲状，两端钝圆，无分枝；细胞排列呈单个、成对及“V”字形，有栅状或不规则聚块；分裂的细胞大小为0.7～0.9*1.0～3.4um。由于生物素充足，繁殖的菌体细胞均为谷氨酸非积累型细胞。 二、谷氨酸发酵不同阶段的菌体形态从谷氨酸发酵中菌体形态的变化来看,大致可以分为长菌型细胞、转移期细胞和产酸型细胞3种不同时期的细胞形态。 三、谷氨酸发酵感染噬菌体后的菌体形态发酵前期感染噬菌体后，菌体细胞明显减少,细胞不规则，发圆、发胖，缺乏“Ｖ”字形排列，有明显的细胞碎片，严重时出现拉丝、拉网，互相堆在一起，几乎找不到完整的菌体细胞,类似蛛网或鱼翅状。在发酵中、后期感染噬菌体后，菌体细胞形态不规则，边缘不整齐，有的边缘似乎有许多毛刺状的东西，有细胞碎片。 第三节谷氨酸生产菌的育种1，日常菌种工作 第三节谷氨酸生产菌的育种育种思路 第三节谷氨酸生产菌的育种育种思路1.切断或减弱支路代谢2.解除自身的反馈抑制3.增加前体物的合成4.提高细胞膜的渗透性5.强化能量代谢6.利用基因工程技术构建谷氨酸工程菌株 第三节谷氨酸生产菌的育种2，选育耐高渗透压的菌株 第三节谷氨酸生产菌的育种3，选育不分解利用谷氨酸的突变株：即选育以谷氨酸为唯一碳源菌体不长或生长微弱的突变株。 第三节谷氨酸生产菌的育种4，选育细胞膜渗透性好的突变株 第三节谷氨酸生产菌的育种5，选育强化CO2固定反应的突变株 第三节谷氨酸生产菌的育种6，选育减弱乙醛酸循环的突变株 第三节谷氨酸生产菌的育种7，选育强化三羧酸循环中从柠檬酸到a-酮戊二酸代谢的突变株 第三节谷氨酸生产菌的育种8，选育解除谷氨酸对谷氨酸脱氢酶反馈调节的突变株 第三节谷氨酸生产菌的育种9，选育强化能量代谢的突变株 第三节谷氨酸生产菌的育种10，选育减弱HMP途径后段酶活性的突变株 第四节利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌一、应用原生质体融合新技术选育谷氨酸生产菌1)标记菌株的筛选；2)原生质体的制备；3)原生质体的再生；4)原生质体的融合；5)融合子的选择；6)实用性菌株的筛选。 第四节利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌二，应用转化法选育谷氨酸生产菌所谓转化，是指受体细胞直接吸收了来自供体细胞的DNA片段，并将它整合到自己的基因组中，从而获得了供体细胞部分遗传性状的现象。转化作用需要受体菌和转化DNA。转化既是进行细菌遗传分析的有效工具，亦是微生物育种的有效方法。 第四节利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌三，应用转导法选育谷氨酸生产菌所谓转导，是指通过温和型噬菌体为媒介，将供体细脑中的DNA片段携带到受体细胞中，从而使受体细胞获得了供体细胞部分遗传性状的现象。转导作用需要三个组成部分，即供体菌，转导噬菌体，受体菌。由于绝大多数细菌(包括谷氨酸生产菌在内)都有噬菌体，所以转导远较转化作用普遍。又因为转导DNA位于噬菌体蛋白质外壳内，所以不会像转化DNA那样容易被外界的DNA分解酶所破坏，因此比较稳定。转导同转化一样，也是微生物育种的有效方法。 第四节利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌四、应用重组DNA技术选育谷氨酸生产菌重组DNA技术也称为基因工程，它是在分子遗传学理论的基础上发展起来的。它综合了生物化学和微生物学的现代技术和手段在离体条件下将某种生物的基因与作为载体的DNA分子连接起来，然后转化到某一寄主细胞中，使之进行复制并得以表达，从而使寄主菌获得新的遗传性状。利用重组DNA技术，可以使编码限速酶的基因扩增以排除生物合成途径中的“瓶颈”，从而使谷氨酸产量增加。因比重组DNA技术是提高谷氨酸产量的一种新的有效手段。 第四节利用生物工程新技术选育谷氨酸生产菌五、应用固定化细胞技术发酵生产谷氨酸固定化细胞是60年代后期发展起来的一项新技术，是通过物理的或化学的方法将细胞束缚在一定区间内使之仍具有催化活性的固定化生物催化剂。由于它既能保持酶或微生物细胞的催化功能，又能使细胞很方便地与反应液分离，并能进行重复使用，所以对原材料的合理利用，缩短不必要的操作时间，防止环境污染及进行现代化的工业生产部具有重要的现实意义。 举例：通过基因工程构建谷氨酸生产菌B44在谷氨酸生产中，依其代谢途径，把不必要的代谢途径(经诱变阻断了a一酮戊二酸到琥珀酰CoA和乙醛酸两条代谢途径)切断后，同时诱变出细胞渗漏型甘油缺陷B4，以便让谷氨酸有效外漏，解除因代谢途径改变后细胞内代谢产物谷氨酸过度积累而产生的反馈抑制，谷氨酸产量有一定提高(经诱变筛选得到的营养缺陷型突变株B4比其出发菌株Bl提高产酸率18.6％和对糖的转化率提高12.3％)。 举例：通过基因工程构建谷氨酸生产菌B44 举例：通过基因工程构建谷氨酸生产菌B441.1，菌株和质粒 举例：通过基因工程构建谷氨酸生产菌B441.2培养基和培养条件 举例：通过基因工程构建谷氨酸生产菌B441.2培养基和培养条件 举例：通过基因工程构建谷氨酸生产菌B441.3DNA的提取与纯化1.4PCR克隆pfkA基因1.5重组质粒Ku一1的构建及重组菌的筛选和鉴定1.6重组质粒的稳定性1.7磷酸果糖激酶活性测定1.8糖转化率和谷氨酸生成比较 举例：通过基因工程构建谷氨酸生产菌B44结果：经基因工程改造后的B44对糖的转化率有所提高，谷氨酸产量有较大的提高，这主要是增大磷酸果糖激酶剂量，解除了EMP途径中的磷酸果糖激酶的限制，以致解除了磷酸果糖激酶对已经改造的谷氨酸整个代谢途径的限制，故物流代谢增强。以致B44对糖的转化率有所提高，谷氨酸产量有较大的提高。 第五节菌种的扩大培养和种子的质量要求国内谷氨酸发酵种子扩大培养普遍采用二级种子培养的流程，即；斜面菌种----一级种子培养----二级种子培养----发酵罐。 第五节菌种的扩大培养和种子的质量要求一，菌种的扩大培养1．斜面菌种的培养 第五节菌种的扩大培养和种子的质量要求一，菌种的扩大培养2．一级种子培养 第五节菌种的扩大培养和种子的质量要求一，菌种的扩大培养2．一级种子培养 第五节菌种的扩大培养和种子的质量要求一，菌种的扩大培养3．二级种子培养(1)培养基组成 第五节菌种的扩大培养和种子的质量要求一，菌种的扩大培养3．二级种子培养 第五节菌种的扩大培养和种子的质量要求一，菌种的扩大培养3．二级种子培养 第五节菌种的扩大培养和种子的质量要求二，影响种子质量的因素1．培养基构成：种子培养基要求合有丰富的氮源，足够的生物素，少量的碳源，以利于菌体生长。如果糖分过多，菌体代谢活动旺盛，产生有机酸，使PH降低菌种容易衰老。2．温度；幼龄菌对温度变化敏感，应避免温度过高和波动大。3．PH值：零小时时PH不宜过高，培养结束PH不宜过低，PH上升后有所下降时，培养时间已接近结束。4．溶解氧：长菌阶段对氧要求比发酵时低，溶氧水平过高，抑制长菌。5．接种量：种量过少，菌体增长缓慢，适应期长，培养时间长，影响种子活力。但种量过大，在拼瓶操作中易引起污染。一般种且以1％左右为宜。6．培养时间：培养时间不宜太长，以7—8h为好，掌握对数生长期作为种子接入发酵罐。 总结谷氨酸生产的种子制备制备过程斜面菌种→一级种子培养→二级种子培养→发酵 （1）斜面(AS1.299)培养基：蛋白胨1%，牛肉膏1%，氯化钠0.5琼脂2%，pH7.0-7.2培养基特点：有利于菌体的生长，原料比较精细培养条件：32℃，生长18-24小时生长斜面要求：生长良好，所使用斜面连续传代不超过3次 （2）一级种子（摇瓶）培养条件：于1000ml三角瓶中，装液200-250ml,32℃培养12小时。培养基：葡萄糖2%，尿素0.5%，玉米浆2.5%，K2HPO40.1%培养基特点：有利于菌体的生长，所使用的原料已经基本接近于发酵培养基 （3）二级种子(种子罐)培养条件：在种子罐中培养（容积为发酵罐的1%），32℃培养7-10个小时培养基：和一级种子相似，其中葡萄糖用水解糖代替，浓度为2.5%培养基的特点：长菌体，更接近于发酵培养基 （4）种子的质量要求：108-109个/ml大小均匀，呈单个或八字排列PH7.0-7.2时结束，6.8→8→7.0-7.2活力旺盛 孕产妇肺栓塞的早期识别和处理64 发生概况欧美国家孕产期肺栓塞的发生率为0.01～0.04％；是同龄非妊娠妇女的5倍，产后2个月之内发生率高于产前2～3倍；国内调查了9621例孕妇，发生率0.003%,(?)孕产妇因肺栓塞造成猝死的有34％发生在1h内，39％在24h内，27％在3～5d内。↑65 妊娠合并肺栓塞的高危因素高凝状态静脉淤滞血管损伤经典的三联好发因素66 高危因素年龄大于35岁；长期卧床孕妇；体重增长过多孕妇；产次大于3次；手术产；(急诊剖宫产大于择期)出血，感染；Incidence,clinicalcharacteristics,andtimingofobjectivelydiagnosedvenousthromboembolismduringpregnancy,ObstetGynecol1999;94(5):73067 国内刘宝瑛等调查了18所医院的孕产妇共93651例，DVT49例，其中PE3例;．DVT发病率为0.052％；PE发病率为0．003％；围生期深静脉血栓患者的高危因素为：剖宫产、妊娠高血压疾病、多产、输血、妊娠合并症、产后应用止血药、产后出血、卧床时间长、产褥期多于妊娠期。68 临床表现猝死型；急性肺心病型；肺梗塞型；不可解释的呼吸困难；69 主要症状突发原因不明的呼吸困难：呼吸频率浅而快，占90％；与体位变化有关。胸痛：胸骨前似心绞痛或心肌梗塞样占70～80％；咯血，咳嗽：阵发性咳嗽，50％；惊恐和频死感，晕厥：20～30％；其他：胸闷、气短、恶心、呕吐、腹痛等70 主要体征呼吸加快，心率增加：次数大于100次／min。紫绀：约20％病例伴有紫绀。周围循环衰竭：血压下降或休克及组织灌注不良所致。急性肺动脉高压和右心功能不全表现：约20％患者有这些体征。患侧肺部可闻及湿哕音，有时还可闻及胸膜摩擦音及心包摩擦音。非特异性71 诊断常见症状：无特异性；突发原因不明的呼吸困难；90％胸骨前酷似心肌梗塞样疼痛；不明原因的心肺功能减退；烦躁不安、惊恐、濒死感、出冷汗、血压下降、休克、晕厥急性肺栓塞发作的特征，急救的关键信号误诊、漏诊率高；死亡率高72 虽然肺栓塞没有典型的症状，但是14～24％的肺栓塞是由继发于未诊断或未治疗的深部静脉栓塞。这类肺栓塞死亡率约15％，2/3患者死于发病的30分钟之内。Deepvenousthrombosisandpulmonaryembolism.ObstetGynecol2006;101(5):98573 初筛检查D二聚体测定：明显增高。敏感性为98％，特异性为30％。动脉血气：主要表现为低氧血症，由于心肺血管床受阻，氧分压(PaO2)降低，而肺泡死腔增大，出现过度通气，导致二氧化碳分压(PacO2)降低。心电图检查：最常见而且最早出现的是窦性心动过速．各种房性快速心律失常，如房颤。74 初筛检查胸部x线检查：其特异性差①肺动脉阻塞征；②肺动脉高压征及右心扩大征；③肺组织继发改变：肺不张，胸腔积液等75 初筛检查超声心动图检查：二尖瓣开放度减小；三尖瓣和肺动脉瓣开放度降低等；右心室扩大；右心室收缩、舒张幅度减弱；室间隔偏移或矛盾运动；左、右心室内径比例减小；肺动脉扩张；76 确诊试验放射性核素肺通气／灌注扫描(ventilation／qer．fusion，V／Q)能反映肺栓塞的特征性改变。①肺通气扫描正常，而灌注扫描呈典型肺段分布的灌注缺损，则高度怀疑PE。②病变部位既无通气也无血流灌注，可能为肺实质病变，不能诊断PE(肺梗死除外)。③肺通气扫描异常，灌注无缺损，为肺实质性疾病。④肺通气和灌注扫描均正常，可除外PE。V／Q是目前国际上公认的诊断肺栓塞最敏感而无创伤的检查方法77 确诊试验螺旋CT：采用特殊技术进行CT肺动脉造影(CTPA)，对肺栓塞的诊断有决定性意义。主要显像有：充盈缺损、肺动脉截断及血流不对称等表现。阳性率高达80％一90％。其最大优点为无创、诊断率高。78 确诊试验磁共振显像(MRI):对段以上肺动脉内血栓的诊断敏感性和特异性均较高。肺动脉造影:血管腔内充盈缺损；肺动脉截断现象；某一肺区域血流减少。此种方法曾被视为PE诊断的金标准，可检测到直径小至0．5cm的血管。79 这些检查对胎儿安全吗？胸部X线、肺动脉造影和肺V/Q显像三种检查所引起的胎儿放射线总量<0.5rad。<5rad不会引起胎儿异常或流产的增加。妊娠l0一l7周时，此期胎儿中枢神经系统最敏感。哺乳期妇女在接受99mTc检查后15h不应哺乳，因这时99mTc在乳汁中大量分泌。80 1.螺旋CT或2.V/Q显像1.正常螺旋CT2.正常V/Q显像排除PE1.螺旋CT不诊断2.V/Q显像低至中度可能性下肢超声1.螺旋CT诊断2.V/Q显像高度可能性推测可能会存在DVT和PE考虑重复检查或额外的试验诊断PE阴性阳性肺栓塞PE的诊断81 治疗:给氧：氧浓度以维持PaO2在70～100mmHg为宜。抗休克：留置中心静脉导管，监测心排血量、肺动脉压。方法：多巴胺5～10ug／(kg.min)、多巴酚丁胺3.5～10.0ug／(kg.min)或去甲肾上腺素0.2～2.0ug／(kg.min)，维持平均动脉压>80mmHg，心脏指数>2.5L/min.m2及尿量>50ml／h。治疗恰当、及时是影响预后的关键82 对症治疗止痛：吗啡5～10mg皮下注射，或盐酸哌替啶50～100mg肌内注射。解痉：阿托品0.5～l静脉注射或654-210～20mg肌内注射，以减低迷走神经张力，防止肺动脉和冠状动脉反射性痉挛。必要时可l～4小时注射1次。心衰治疗：西地兰0.2～0.4mg加入50％葡萄糖溶液40ml内静脉注射，必要时于4—6小时重复用药。83 对症治疗支气管痉挛：氨茶碱0．25g加入50％葡萄糖液40ml内静脉注射，必要时可用地塞米松l0mg静脉注射。控制心律失常：快速室性心律失常，利多卡因50～100mg静脉注射，继以12mg／min静脉滴注。快速房性心律失常，西地兰0.2～0.4mg加入50％葡萄糖液20～40ml静脉注射或维拉帕米(异博定)5mg加入50％葡萄糖液20～40ml静脉注射。84 溶栓治疗溶解血栓，恢复肺组织再灌注逆转右心衰竭，增加肺毛细血管血容量及降低病死率和复发率。①链激酶(SK)负荷量25万U／30min，继l0万U／h，维持72小时静脉滴注。链激酶分子量高而不通过胎盘，是常用的溶栓剂。②或尿激酶(UK)负荷量25万U／10～20min，继20万U／h，维持24小时静脉滴注。以上两种药应用之前用异丙嗪25mg，地塞米松5mg滴注预防副反应。85 抗凝治疗①肝素：首次剂量5000u或80u/kg静脉注射，继以18u/kg静脉滴注，维持浓度40u/min。肝素使用最初24小时，每4～6小时行部分凝血活酶(APTT)检查，根据APTT调整用量，使APTT达到并维持于正常值的1.5～2.5倍，情况稳定者持续用药7—10天，总剂量每天36000～42000U。86 推荐用法：②低分子肝素：是一种新型抗凝药物，可避免一些肝素引起的并发症，如出血、血小板减少、骨质疏松等，不影响出凝血时间。开始剂量1mg/kg每12小时1次，分娩时减量至40mg，每12小时1次，产后4～6小时恢复同前剂87 ③华法林：一般用于产后。使用肝素的第1～天即可开始，每天口服5～l0mg。以控制APTT为正常的1.5～2.5倍。若肺栓塞发生于晚孕期，则产后抗凝药应至少持续用3个月；栓子来源不明的首发病例，至少需给予6个月的抗凝；复发性PE或高危因素长期存在的患者，抗凝治疗的时间应更加延长。88 哪些孕妇需要预防PE?心脏病病史的孕妇；第三胎或多胎孕妇；高龄或肥胖孕妇；妊娠或产褥期卧床时间明显延长者；行急诊剖宫产，尤其合并其他危险因素的孕妇；89 如何预防？药物联合分级加压弹力袜和间隙充气加压泵预防血栓（2C级）；血栓危险因素持续存在的患者，建议产后继续进行血栓预防4～6周(2C级)；存在血栓危险因素但是无静脉栓塞病史的患者，不推荐产前常规应用抗凝药物预防血栓，而应个体化评估血栓的风险(1C级)；无血栓危险因素而既往曾发生过特发性VTE、推荐预防剂量的LMWH/UFH，或怀孕期间进行密切监测，同时产后抗凝(1C级)抗心磷脂抗体阳性，反复流产或晚期流产，没有静脉或动脉血栓栓塞病史的女性，建议产前应用预防剂量的UFH或LMWH，同时联合应用阿司匹林(1B级)。90 谢谢聆听91'