最新多态性与结核易感性研究课件PPT.ppt 129页

'多态性与结核易感性研究 前言----启示2003年:SARS的启示1.诊断性研究特异性--正常人群敏感性—患者-1例-山东省胸科医院2.失败的教训:易感性研究HLA与SARS患者易感性研究求助×合作×建议×3.2003年12月,其他实验室工作发表 前言----框架山东省胸科医院防治网络学会研究中心领头羊作用(多中心合作,资源共享平台)国际合作国内合作区域合作 结核病易感人群-3需要说明的问题?为什么存在结核病高发区和低发区?在结核病高发区和低发区中,社会经济发展的状况差别?不同区域之间的差别?同一民族不同群体差别?不同种族之间的差别?上述群体的遗传学背景有无差别? 结核病易感人群-4需要说明的问题?卡介苗预防接种者都不发病吗?已感染者发病的年龄有关吗?感染者和已感染者发病的性别有关吗?已感染者进行预防治疗后都不发病吗?上述群体的遗传学背景有无差别? 免疫学基本问题-1-抗原识别抗原识别(APC细胞)与MHC(HLA)分子结合形成抗原肽－MHC复合物再提呈给T细胞形成抗原肽－MHC—TCR三元体结构 免疫学基本问题-2-T细胞的活化增殖-11.T细胞的活化增殖T细胞的完全活化并增殖分化为效应细胞需要两个独立且有协同作用的信号，即双信号作用。第一信号通过TCR传提，由抗原自身提供（即抗原识别），即TCR与抗原肽-MHC分子复合物结合，第一信号决定免疫应答的抗原特异性 免疫学基本问题-2-T细胞的活化增殖-2第二信号则来自APC上的共刺激分子（co-stimulatorymolecule），共刺激分子与T细胞表面的相应受体结合，为T细胞的活化增殖提供共刺激信号，第二信号是非抗原特异性的仅有第一信号而缺乏共刺激信号，T细胞则不能被激活，因此，共刺激分子提供的第二信号在T细胞活化上发挥了重要作用 免疫学基本问题-2-T细胞的活化增殖-3APC上的B7分子，包括B7-1（CD80）和B7-2（CD86）分子，被认为是一类重要的共刺激分子，它们与T细胞上相应的受体分子CD28相结合，经CD28转导活化信号，增强T细胞对抗原应答，由B7/CD28发出第二信号，增强细胞因子（如IL-2）基因的转录及其mRNA的稳定性，而使T细胞增殖。若阻断B7/CD28信号通路，可诱导抗原特异性免疫耐受 免疫学基本问题-2-T细胞的活化增殖-4CD40与其配体CD40L(CD154)也是一对共刺激分子，表达于DC上的CD40一方面通过与T细胞上的CD40L结合,共刺激T细胞使之活化，另一方面T细胞上的CD40L通过与CD40结合而给DC提供刺激信号，促进其成熟，使其MHC分子、辅助刺激分子和粘附分子的表达明显增强，继而促进T细胞的活化T细胞上CD40L与DC上CD40的交联还能促进IFN-γ的分泌和T细胞增殖。 免疫学基本问题-2-T细胞的活化增殖-5近年来有学者提出了T细胞活化的三信号学说，即各种激活的免疫细胞分泌细胞因子(cytokine,CK)如IL-2等与其相应受体(IL-2R)特异性结合，为T细胞的后续激活提供了第三信号 免疫学基本问题-2-B细胞的活化增殖-1B细胞的活化过程与T细胞相似，主要区别在于：①B细胞由B细胞受体（BCR）识别特异性抗原，T细胞由TCR识别特异性抗原②B细胞转导信号的分子是Igα/Igβ，T细胞转导信号的分子是CD3③在B细胞，酪氨酸活化基序（ITAM）磷酸化后第一个被募集的酪氨酸激酶是SyK，而在T细胞是ZAP-70④在B细胞，鸟苷酸交换因子（GEFs）激活的小G蛋白质是Ras和Rac，而在T细胞则仅为Ras⑤在B细胞有B细胞特异转录因子如B细胞特异激活蛋白质（BSAP），而在T细胞则有T细胞特异转录因子（NFAT） 免疫学基本问题-2-B细胞的活化增殖-2B细胞的增殖分化涉及到许多细胞因子，其中绝大多数是由Th2细胞分泌的。APC把抗原（天然抗原或抗原-抗体复合物）提呈给静息B细胞的同时，也分泌IL-1，作用于B细胞。活化B细胞mIgD消失，胞膜表达一些新的细胞因子受体，如B细胞生长因子（BCGF）、IL-2和IL-5的受体。B细胞增殖中又表达IL-6、IL-10及IFN-γ等细胞因子受体。最后B细胞分化为分泌不同Ig的浆细胞。在B细胞活化、增殖与分化过程中，均需Th细胞的辅助 免疫学基本问题-3-免疫应答免疫应答反应涉及多种效应细胞和分子，主要可以归纳为以下三种机制:1.CD4+Th1细胞介导的炎症反应2.CD8+CTL介导的细胞毒效应3.抗体介导的体液免疫反应 免疫学基本问题-4-免疫耐受免疫耐受（immunologicaltolerance）是免疫系统对特定抗原产生的非损害性的免疫反应，并保护机体免受同样抗原再次刺激时所致的损害。是免疫应答反应的一种特殊形式，其有别于免疫抑制疗法和遗传缺陷所造成的非特异性免疫抑制、低下或缺陷。 DCs细胞顺气管分布图－－DCs网络DCs细胞来源:DCsarederivedfrombonemarrowprogenitorsandcirculateinthebloodasimmatureprecursorspriortomigrationintoperipheraltissuesTissue-residentdendriticcells(DCs)thatmigratefromperipheralsitestolymphoidorgansareessentialintheinitiationofadaptiveimmuneresponsesandforthemaintenanceofperipheraltolerance,andhavebeenextensivelystudied.Bycontrast,blood-borneDCsrepresentaheterogeneouspopulation,theorigin,destinationandfunctionofwhicharestillunclear.RecentstudieshaveshownthatcirculatingDCscaptureblood-borneantigenandtransportitintotheextra-vascularspaceoflymphoidtissuesforprocessingandpresentation.Otherfindingssuggestthatafractionoftissue-residentDCsmightenterthebloodafterhavingacquiredantigenintheperiphery.Together,thesestudiesimplythatcirculatingDCsmightmodulateimmuneresponsesbytranslocatingantigenicmaterialfromitspointoforigintoremotetargettissues.RobertoBonasioandUlrichHvonAndrian.Generation,migrationandfunctionofcirculatingdendriticcells.CurrentOpinioninImmunologyVolume18,Issue4,2006,503-511 Th1/Th2或Type1/Type2型细胞因子细胞因子作用具有双面性（可治病也可致病）、多样性（一种细胞因子多种功能，一种功能多种细胞因子所共有），以及网络性（各细胞因子间既可相互促进也可抑制）,故用细胞因子治病和分析细胞因子与疾病的关系时应慎重。 Th1/Th2细胞因子的产生细胞-1细胞Th1型细胞因子Th2型细胞因子Th0IL-2,IFN-γ,TNF-βIL-4-6、9、10Th1IL-2,IFN-γ,TNF-βTh2IL-4-6,9,10,13Tc1IL-2,IFN-γ,TNF-βTc2IL-4-6、9、10 Th1/Th2细胞因子的产生细胞-2细胞Th1型细胞因子Th2型细胞因子NKIFN-γ肥大细胞IL-4、10B细胞IL-4、10巨噬细胞IL-6、10 Type1,type2型细胞因子命名-1CellsourceCytokine(s)Type1Type2CD4+TcellIL-2,IFN-,TNF-IL-4-6,10,13CD8+Tcellβ,IL-12IL-4、5、10NKcellIL-2,IFN-γMonocyte/IFN-γ,TNF-βIL-6、10macrophageIFN-γ,TNF-βIL-6、10 Type1,type2型细胞因子命名-2CellsourceCytokine(s)Type1Type2BcellIL-12,IL-15IL-6、10DendriticcellIL-12,TNF-βNeutrophilIL-12MastcellIL-12IL-4、5、6EosinophilIL-4、5、6 TypeI型反应/TypeII型反应这种命名着眼于细胞因子的功能而非它的来源，既包括了CD4+和CD8+细胞，又考虑了其他非T细胞来源的细胞因子。基于这种原则，将免疫反应增强，IL-2，IFN-γ，TNF-β，IL-12水平升高或正常，这种生理状态定义为TypeI型反应。而将细胞反应减弱，一项或多项B细胞活性增高（如自身抗体生成或超IgE等），以及IL-4，IL-5，IL-6，IL-10，IL-13升高等定义为TypeII型反应。 TypeI型反应/TypeII型反应这种命名原是强调TypeI（细胞免疫）和TypeII（体液反应）的相对优势，而非绝对分裂。既然许多疾病的病程状态都有一个从轻微到严重的过程，那么极有可能在疾病的各个阶段细胞因子的产生、失衡或调节异常也存在着这样一个过程。Type1和Type2型细胞因子调节异常在疾病的诊断与细胞因子优势之间找到一定联系，是不断探索和发展的过程，且存在许多困难，主要问题是： 问题免疫学基本问题已经清楚:抗原识别-细胞活化增殖-免疫反应.这三个环节涉及许多分子,这些分子水平的高低决定免疫反应的强弱.是什么决定了这些分子水平的高低呢?与个体的多态性有关? 人类主要组织相容性复合体（MHC）系统（一）概述主要组织相容性复合体（majorhistocompatibilitycomplex,MHC）是指一组编码MHC抗原或MHC分子的基因系统。它是染色体上的一群紧密连锁的基因群，因其在同种异体器官/组织移植排斥反应中发挥重要作用而得名。人类MHC分子在白细胞等有核细胞膜上大量表达，因此又被称为人类白细胞抗原系统（humanleukocyteantigen,HLA）。人类MHC由一组连锁基因组成，位于人类第6号染色体短臂上的6p21.31和6p21.32之间，全长约400万个碱基对（basepairs,bp），是调控人体特异性免疫应答和决定疾病易感性个体差异的主要基因系统 （一）概述人类HLA基因图谱 （一）概述HLA复合体的结构十分复杂，主要表现在多基因性和多态性两个方面。多基因性（polygenic）是指MHC由一组（多个）位置相邻的基因座位组成，各自的产物具有相同或相似的功能。多态性（polymorphism）是指一个基因座位上存在多个等位基因（allele）。根据HLA基因功能和产物结构的不同可分为3组：即经典HLA基因、免疫功能相关基因和免疫无关基因。 （一）概述1.经典HLA基因是指其编码产物直接参与抗原提呈并决定个体组织相容性的基因，如：HLA-І类基因和HLA-ІІ类基因HLA-A、HLA-B和HLA-C为经典的HLA-І类基因，编码的产物为HLA-І类抗原或分子，由各基因座位编码的重链和15号染色体非HLA基因编码的轻链β2-M共同构成。其编码产物几乎分布于所有的组织细胞上，为细胞膜上的移植抗原，是引起移植排斥反应的主要抗原 （一）概述1.经典HLA基因经典的ІІ类基因主要指HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP等，所编码的产物为HLA-ІІ类抗原或分子，是由分子量相近的α链（35KD）和β链（28KD）组成的异二聚体构成主要分布于免疫细胞（如：DC、B细胞、单核－巨噬细胞、活化T细胞）上，它们可作为免疫细胞间识别标记而诱发免疫应答和调节免疫细胞间相互作用，是一种在免疫应答中发挥重要作用的免疫分子 （一）概述2.免疫功能相关基因均具有一定的多态性，并与机体免疫应答和非特异性免疫调节相关。这些基因位于HLA复合体的中段，被称为HLA-III类基因，主要有3类:（1）血清补体成分编码基因主要编码C2、C4A、C4B和Bf等4种补体成分，这些产物不参与抗原提呈，也不是膜结合分子（2）抗原加工提呈相关基因位于HLA-II类基因区域内，主要包括与免疫应答过程中抗原加工提呈相关的3组基因，均由两个基因座位组成，编码相应的异二聚体分子 （一）概述2.免疫功能相关基因（2）抗原加工提呈相关基因①抗原处理相关转运蛋白（transporterassociatedwithantigenprocessing,TAP）或抗原多肽转运蛋白（transporterofantigenpeptide）基因：其产物主要参与内源性抗原肽向内质网腔的转运②低分子量多肽（lowmolecularweightpolypeptide,LMP）基因：其产物参与对内源性抗原分子的酶解③HLA-DM基因：其产物参与抗原提呈细胞对外源性抗原肽的加工处理，在溶酶体中外源性抗原肽进入HLA-II类分子抗原槽的过程中发挥作用④HLA-DO基因：其产物分别为DO分子的α链和β链，主要参与对DM功能的负调节⑤TAP相关蛋白基因：其产物为TAP相关蛋白,参与内源性抗原多肽的加工提呈，对HLA-I类分子在内质网中的组装合成发挥重要作用 （一）概述2.免疫功能相关基因（3）炎症相关基因这类基因位于HLA-III类基因区内靠近HLA-I类基因的一端。主要有：①肿瘤坏死因子（TNF）基因家族，包括TNF-α和TNF-β（LT）基因②热休克蛋白（HSP）基因家族③其他基因家族:在HLA-III类基因区还发现了其他一些炎症相关基因，如MHC-I类相关基因家族（MIC-A、MIC-B等）、转录调节基因/转录因子基因家族等 （一）概述2.免疫功能相关基因（4）非经典HLA-I类基因除经典HLA-I类基因外，在HLA复合体I类基因区还有许多其他基因，如：HLA-E、F、G和X基因等，被称为非经典HLA-I类基因，或HLA-Ib基因。它们的编码产物也与β2-M结合，并表达于细胞膜上，但组织分布非常有限，多态性不明显，免疫学功能尚未完全清楚3.免疫无关基因HLA复合体中还存在一些与免疫应答无关的基因，如位于HLA-III类基因区内的21羟化酶（CYP21）基因等 （二）HLA特异性及其命名1.HLA抗原及等位基因命名1964年在美国召开了第一次国际性的组织相容性试验专题讨论会（HistocompatibilityTestingWorkshop）.截至2005年止，已经举行了14届国际性的组织相容性试验专题讨论会随着新的等位基因及其基因亚型的不断发现，HLA等位基因的数字编号位数已经增加到了8位，如：HLA-A*24020101，星号后的数字编号前两位代表等位基因家族（相当于血清学检测的抗原特异性），第3、4位代表等位基因亚型（其表达产物存在氨基酸序列差异），第5、6位代表非编码（同义核苷酸）多态性，最后两位代表内含子3’或5’端多态性。有的等位基因数字编号后面出现大写字母N或L，N表示该基因不表达，L表示该基因非编码区发生突变，基因产物表达量下降。至2006年7月，HLA区域已发现的等位基因数总和已达到2524个，能用血清学或细胞学检出的HLA特异性总数已达到164种 历年发现的HLA抗原和基因 （二）HLA特异性及其命名2.HLA分子结构及特点（1）HLA-Ι类分子重链(α链)和轻链(β2微球蛋白)所组成的异二聚体.其胞外段有三个功能结构区（α1、α2、α3），远膜端的两个结构域α1和α2为肽链的可变区:可变区的凹槽内约有20个氨基酸的种类易发生变化，这与HLA-Ι类分子能选择性地结合抗原密切相关.只有与HLA-Ⅰ类分子抗原结合凹槽最吻合的抗原多肽，才能与之结合并将抗原提呈给CD8+T细胞的TCR，凹槽外部的氨基酸残基是HLA-Ι类分子被TCR直接识别的部位 （二）HLA特异性及其命名2.HLA分子结构及特点（1）HLA-Ι类分子重链α3构成HLA-Ι类分子的恒定区，是T细胞表面CD8分子的识别部位。当CD8+T细胞TCR与抗原提呈细胞表面的多肽－HLA-Ι类分子复合物结合时，CD8分子也与HLA-Ι类分子结合，从而加强抗原提呈细胞与T细胞之间的粘附，促进CD8+T细胞的活化α3和β2微球蛋白(β2-M)均属免疫球蛋白超家族(IgSF)结构域，β2-M以非共价键与α重链相连且游离于细胞之外，与α重链的表达、运输及稳定密切相关 （二）HLA特异性及其命名2.HLA分子结构及特点（2）HLA-ΙΙ类分子由α链和β链通过非共价键连接形成异源二聚体，α链和β链均为穿膜蛋白，都有胞外区、跨膜区和胞内区，胞外区各有两个功能区（α1、α2）和（β1、β2），α1和β1为肽链的可变区，共同构成抗原结合部位HLA-ΙI类分子的抗原结合凹槽末端常呈开放状态，能够结合的抗原肽相对较长，可达10～25个氨基酸多肽。相对来说，β1更具有多态性，因而在抗原结合中更为重要 （二）HLA特异性及其命名2.HLA分子结构及特点（2）HLA-ΙΙ类分子α2和β2均含内部二硫键，构成恒定区，属免疫球蛋白超家族（IgSF）结构域。细胞外源性抗原经抗原提呈细胞以胞吞方式摄入胞浆中的内体和溶酶体，在吞噬小体的酸性环境中由溶酶体酶降解成抗原多肽，降解的抗原经抗原提呈细胞表面的HLA-ΙΙ类分子提呈给CD4+T细胞，T细胞表面的CD4分子与HLA-ΙΙ类分子的β2区结合。从而激活CD4+T细胞。HLA-ΙΙ类分子仅表达于淋巴样组织中的各种细胞表面，如专职抗原提呈细胞（包括B细胞、巨噬细胞、树突状细胞）、胸腺上皮细胞和活化T淋巴细胞等。 （三）HLA的遗传特点1.单体型遗传HLA是以单体型为单位由亲代传给子代，即具有连锁遗传的特点。子代可随机地从亲代双方各获得一个HLA单体型，组成子代新的基因型。因此，同胞兄弟姐妹中两个单体型完全相同的概率为1/4，一个单体型相同的概率为1/2，两个单体型完全不同的概率也是1/4。2.共显性遗传HLA遗传方式表现出共显性遗传的特点，即每个等位基因所编码的蛋白质分子都能够在细胞膜上表达，无隐性基因，也没有等位基因排斥现象3.连锁不平衡 （四）HLA生物学功能HLA作为代表个体特异性的主要组织相容性抗原。HLA的生物学功能主要是参与抗原的识别、加工和提呈，其他作用均由其抗原提呈功能衍生而来，如：对免疫应答的遗传控制、免疫细胞间相互作用的限制性、免疫调节、免疫细胞分化及中枢性自身耐受的建立等 （四）HLA生物学功能T细胞通常只识别APC提呈的抗原肽－HLA分子复合物，这一识别是通过T细胞和APC之间的“TCR－肽－HLA”三分子复合结构而完成。抗原的加工和提呈严格受控于HLA系统，主要表现在：①HLA分子及HLA相关蛋白参与抗原的酶解和抗原多肽的转运②HLA分子与抗原肽结合并转运至细胞膜表面③HLA分子对抗原肽结合和提呈具有明显的选择性④HLA限定T细胞受体对抗原的识别而HLA-Ⅲ类基因以及新近确认的多种免疫功能相关基因,则不具备提呈特异性抗原肽、激活T细胞的功能 （四）HLA生物学功能T细胞通过TCRα、β链分别以各自的CDR1和CDR2结构识别HLA分子，主要以其CD3识别位于HLA分子抗原肽结合凹槽中的抗原多肽。TCR的CDR通常位于高变区，代表TCR和配体（抗原肽－HLA分子）相结合的关键部位。同时，辅助性T淋巴细胞（Th）表面的CD4分子作为共受体与HLA-II类分子非多态性的α2/β2结构域结合，细胞毒T淋巴细胞（CTL）表面的CD8分子作为共受体则与HLA-I类分子的α3结构域结合。因此，HLA-II类分子参与CD4+Th细胞的抗原识别，而HLA-I类分子参与CD8+TCL细胞识别抗原 （四）HLA生物学功能外源性抗原由APC以胞吞方式摄入胞浆中的内体和溶酶体，抗原在内体和溶酶体酸性环境中被蛋白酶分解成多肽片段。其中大部分抗原被降解后丧失了免疫原性，只有小部分抗原肽保留免疫原性。与此同时，HLA分子在内质网腔中合成，其中HLA-ΙΙ类分子形成了一个抗原结合凹槽，使经过加工处理后具有免疫原性的外源性抗原肽能够与HLA-ΙΙ类分子结合形成复合物。最后，抗原肽-HLA-ΙΙ类分子复合物从溶酶体移至APC表面，供CD4+Th细胞的TCR识别 （四）HLA生物学功能内源性抗原大多为细胞内产生的非己蛋白质成分，可以是细胞DNA被病毒整合后出现的病毒蛋白，也可以是基因突变后新产生的肿瘤抗原或衰老凋亡和修饰变性了的自身组织抗原结构。其特点是内源性抗原直接出现在胞质溶胶中胞质溶胶中有一种特定的蛋白质酶解结构叫蛋白酶体（proteasome），外观呈圆筒状，分4层，每层由7个亚单位组成。当抗原进入并经过中间两层时，可因其中催化亚单位的作用而迅速酶解成肽段。抗原肽离开蛋白酶体后先和热休克蛋白（HSP）结合，然后转运到内质网膜上的一个特定结构，即抗原加工相关转运物（TAP） （四）HLA生物学功能内质网腔内HLA-Ι类分子重链（α链）合成后，和β2微球蛋白结合并靠向TAP分子，接纳进入内质网腔的抗原肽，并形成抗原肽-HLA-Ι类分子复合物，经高尔基体转运至细胞表面，供CD8+T细胞上的TCR识别。最近认为，CD8+T细胞也可加工和处理外源性抗原的处理和提呈给T细胞，称为交叉提呈（crosspresentation） IL-1B及IL-1RN基因多态性与结核易感性的相关性研究结核病是宿主、病因和环境三者关系失衡，作为内因的宿主在发病中起着重要的作用.若从根本上阐明不同个体或群体对结核易感性的差别，消除或控制不良因素的分布，促进健康因素分布就必须从分子及基因水平进行人群研究 IL-1B/IL-1RN基因及其产物细胞因子网络对侵入体内的结核分支杆菌的清除及慢性肉芽肿的形成起着非常重要的作用IL-1是一种前炎性细胞因子,由单核巨噬细胞产生，LAM、20000和46000结核分支杆菌抗原可诱导IL-1IL-1是内源性致热源，是结核病人发热的可能原因，在试管内感染，可诱导局部促炎性细胞因子IL-6和肿瘤坏死因子产生，上调IL－2受体表达和IL-2的产生 IL-1B/IL-1RN基因及其产物IL-1基因定位于人染色体长臂的2q13上，在430kb的区域内包含着3个家族成员：IL-1A，IL-1B和IL-I受体拮抗剂基因三者分别编码三种前炎性因子IL-1α、IL-1β和IL-1RaIL-1β是一种单核因子，在结核免疫应答中具有十分重要的作用。IL-1Ra是单纯的受体拮抗剂，无任何激动剂活性,能够竞争性地与IL-1受体结合，抑制IL-1的作用,IL-1RN基因第2内含子中存在86bpVNTR，在这个重复区域中有三个潜在的蛋白结合位点，不同重复可影响功能改变，已证实VNTR与多种炎症性疾病有关 IL-1B/IL-1RN基因及其产物IL-1的基因多态性可影响IL-1Ra和IL-1ß的表达及两者比值改变，从而影响机体的免疫反应，影响机体抗感染的能力因此，对结核病患者IL-1B-31,-511以及IL-1RN基因多态性的研究，了解与结核病感染、发病、愈后相关的遗传因素，以期筛选出与结核易感性有关的多态性位点，为结核病的优选干预措施提供科学依据，为制定适宜的预防策略打下基础 主要内容基因芯片法检测结核病患者和正常对照组外周血IL-1B-31和IL-1B-511位点基因多态性PCR-RFLP法检测结核病患者和正常对照组外周血IL-1B-31和IL-1B-511位点基因多态性，对基因芯片法检测结果进行印证PCR法检测IL-IRN基因多态性 技术路线-1-基因芯片对照组和病例组每例均采集2ml静脉血EDTA抗凝提取全血DNA以全血DNA为模板进行PCR扩增IL-1B-31UP5，AGAAGCTTCCACCAATACTC3，IL-1B-31DOWN5，AGCACCTAGTTGTAAGGAAG3，IL-1B-511UP5，GCCTGAACCCTGCATACCGT3，IL-1B-511DOWN5，GCCAATAGCCCTCCCTGTCT3， 技术路线-2-基因芯片杂交：PCR扩增产物＋基因芯片变性处理预杂交杂交显色BaioBE基因芯片检测仪上进行扫描测定由软件自动判断并输出结果 技术路线-3-PCR-RFLP以全血DNA为模板进行PCR扩增IL-1B-31UP5，AGAAGCTTCCACCAATACTC3，IL-1B-31DOWN5，AGCACCTAGTTGTAAGGAAG3，IL-1B-511UP5，GCCTGAACCCTGCATACCGT3，IL-1B-511DOWN5，GCCAATAGCCCTCCCTGTCT3限制性内切酶A1uI酶切IL-1B-31PCR扩增产物限制性内切酶AvaI酶切IL-1B-511PCR扩增产物3％琼脂糖凝胶电泳室温80v1.5h经测序证实GDs800凝胶成像系统分析拍照保存 技术路线-4-PCR-IL-IRN以全血DNA为模板进行PCR扩增IL-1RNUP5’-CCCCTCAGCAACACTCC-3’IL-1RNDOWN5’-GGTCAGAAGGGCAGAGA-3’下同:RFLP -31CC纯合子、-511TT纯合子-31CT杂合子、-511CT杂合子-31CT杂合子、-511CC纯合子-31TT纯合子、-511CC纯合子 IL-1B-511位点基因多态性酶切电泳图（AvaI酶）IL-1B-31位点基因多态性酶切电泳图（AluI酶） IL-1B-RN基因多态性电泳结果M：100bpladder10：442bp,IL-1RN1/1基因型20：270bp,IL-1RN2/2基因型 IL-1B-RN基因多态性电泳结果M：100bpladder90：442bp,IL-1RN1/1基因型89：442bp/270bp,IL-1RN1/2基因型 不同分组数据及统计学结果 对照组与病例组IL-1B-31基因型和等位基因的分布 IL-1B-511基因型和等位基因的分布与结核空洞的关系 小结-1基因芯片方法检测IL-1B-31和IL-1B-511，与PCR-RFLP方法结果一致，其有很多优点:技术操作简单、自动化程度高、序列数量大、检测效率高、应用范围广、成本相对低。 小结-2a.IL-1B-31T等位基因增加结核风险OR值为1.606（95％可信区间为1.027-2.512），TT纯合子基因型增加结核风险OR值为4.207（95％可信区间为1.729-10.235）b.IL-1B-511等位基因T在肺外结核组与肺结核组分布频率为33.3％和55％,增加肺结核的易感性其OR值为2.444c.IL-1B-511TT纯合子基因型在空洞性肺结核组为0％而在非空洞性肺结核中占48.4％，在肺结核患者中，携带TT纯合子基因型减少空洞形成的风险性 小结-3e.等位基因IL-1B-511T和IL-1B-511C在非空洞性肺结核与空洞性肺结核组比较χ2=6.954P=0.008＜0.01，携带T等位基因减少肺结核空洞形成的风险性，其OR值为0.227（95％可信区间为0.072-0.718）d.其余各基因型和等位基因多态性与结核易感性、不同部位结核以及空洞形成无关 济南市中心医院谢谢 第五节建设工程合同 了解合同法的概念、订立的基本程序；熟悉合同法的基本原则、基本形式与主要条款，及合同订立当事人的权利、义务与违约责任等方面的基本知识；掌握建设工程勘察设计合同、建设工程施工合同、工程建设监理委托合同的订立、履行与违约责任等方面的内容。本节提要 建设工程合同：是指建设单位（发包方）与勘察、设计、建筑安装单位（承包方）依据国家规定的基本建设程序和有关合同法规，以完成建设工程为内容，明确双方的权利与义务关系而签订的书面协议。第五节建设工程合同 （一）按内容分勘察合同设计合同施工合同一、建设工程合同种类 （二）按承发包方式总承包（交钥匙）施工总承包管理总承包单位工程施工承包分包合同一、建设工程合同种类 （三）按工程计价固定价格可调价格成本加酬金一、建设工程合同种类 （四）示范文本《建设工程勘察合同》《建设工程设计合同》《建设工程施工合同》《建设工程监理合同》一、建设工程合同种类 建设工程勘察、设计合同：是指发包人与承包方为了完成特定的勘察、设计任务，明确相互的权利与义务关系而签订的协议。勘察、设计合同具有建设工程合同的一切法律特征。二、建设工程勘察设计合同 （一）勘察、设计合同的主要内容：工程概况，工程名称、地点、规模；发包人提供资料的内容、技术要求及期限；承包方勘察的范围、进度与质量，设计的阶段、进度、质量和设计文件的份数及交付日期；勘察设计取费的依据、取费标准及拨付办法；双方当事人的权利与义务；违约责任；争议的解决方式等。二、建设工程勘察设计合同 （二）勘察、设计合同当事人的权利和义务1、发包方的主要义务⑴向承包方提供开展勘察、设计工作所需的有关基础资料，并对提供的时间、进度与资料的可靠性负责；⑵向承包方提供必要的生活和工作条件；⑶负责勘察现场的水通、电通、路通和场地平整工作；二、建设工程勘察设计合同 ⑷及时向有关部门申请取得各设计阶段的批准文件，明确设计的范围和深度；⑸给付勘察、设计费用。⑹尊重勘察设计成果，不得擅自修改，不得转借人使用。⑺合同中含有保密条款的，发包人应承担设计文件的保密责任。二、建设工程勘察设计合同 2、承包方的主要义务⑴按照合同要求按时提交勘察设计成果；⑵初步设计审查后，在原定任务书范围内的必要修改，由承包方负责；⑶对勘察设计成果负瑕疵担保责任；⑷配合施工，进行设计技术交底，解决施工过程中有关设计的问题，负责设计变更和修改预算，参加试车考核及工程竣工验收。二、建设工程勘察设计合同 （三）设计的修改和停止设计文件批准后，不得任意修改和变更；发包人因故要求修改工程设计，经承包方同意后，除设计文件的提交时间另定外，发包人还应按承包方实际返工修改的工作量增加设计费；发包人因故要求中途停止设计时，应及时通知承包方，已付的设计费不退,并按该阶段付清设计费，同时结束合同关系。二、建设工程勘察设计合同 （四）违约责任1、发包方的违约责任⑴发包方未按期提供勘察设计所需的原材料、设备、场地、资金、技术资料，致使工程未能按期进行的，承包方可以顺延工期，承包人由此造成的损失由发包人承担；二、建设工程勘察设计合同 ⑵发包方提供的资料不准确，或中途改变建设计划造成勘察设计工作的返工、窝工、停工或修改计划的，发包人应按承包人的实际消耗工作量增付费用；⑶发包方未能按期接收承包方的工作成果的，应偿付逾期违约金；⑷发包人若不履行合同，定金不予返还。二、建设工程勘察设计合同 ⑴因勘察、设计质量低劣引起返工，勘察、设计单位应当承担返工所支出的费用；⑵勘察设计单位未按期提交勘察设计文件，致使拖延工期造成损失的，由勘察、设计单位继续完善勘察、设计，承担部分的勘察、设计费。⑶由于勘察、设计错误而造成工程重大质量事故的，承包方应承担一定数额的赔偿金；⑷承包方不履行合同，应双倍返还定金。二、建设工程勘察设计合同2、承包方的违约责任 建设工程施工合同：是发包方（建设单位或总包单位）和承包方（施工单位）为完成特定的建筑安装工程任务，明确双方的权利和义务关系的协议。建设工程施工合同是建筑、安装合同的合称。三、建设工程施工合同 （一）概述1、签订施工合同应具备的条件：⑴初步设计和总概算已经批准；⑵项目已列入年度建设计划；⑶有满足承包要求的设计文件和技术资料；⑷建设资金与主要设备来源已基本落实；⑸合同当事人应当具有法人资格；⑹合同当事人双方均具有履行合同的能力。三、建设工程施工合同 2、订立施工合同应具备的主要条款：⑴工程名称和地点；⑵建设工期，中间交工工程的开、竣工时间；⑶工程质量；⑷工程造价；⑸工程价款的结算方式；⑹材料和设备的供应责任；三、建设工程施工合同 ⑺当一方提出延迟开工工期或终止工程时，有关工期变更、承包金额变更或损失的承担及估算方法；⑻由于价格变动而变更承包金额或工程内容的规定和估算方法；⑼竣工验收；⑽违约责任；⑾合同争议的解决方式；⑿其他约定条款。三、建设工程施工合同 （二）发包方的义务P101（三）承包方的义务P102（四）发包方的违约责任P102（五）承包方的违约责任P103三、建设工程施工合同 原告：某建筑工程承包公司被告：某房地产开发公司案例一四、案例 一、基本案情某房地产开发公司欲建一豪华别墅，遂与某建筑工程承包公司签订建设工程施工合同。关于施工进度，双方在专用条件中有详细约定。4月初工程开工，该别墅极为走俏。房地产开发公司曾多次要求建筑公司缩短工期，均被建筑公司以质量无法保证为由拒绝。案例一 为使工程尽早完工，房地产开发公司所派检查人员遂以承包公司名义要求材料供应商提前送货至目的地，造成材料堆积过多，管理困难，部分材料损坏。该承包公司遂起诉该企业，要求其承担损害赔偿责任。房地产开发公司以检查作业进度，督促完工为由抗辩。法院判决该房地产开发公司抗辩不成立，应依法承担赔偿责任。案例一 二、案例分析本案涉及发包方如何行使检查监督权问题。《合同法》规定:“发包人在不妨碍承包人正常作业的情况下，可以随时对作业进度、质量进行检查。”所谓正常作业，是指承包人依据建设工程合同的约定，按施工进度计划表、预先设计的施工图纸及说明书等完成建设工程任务的行为。案例一 在行使监督检查权利的时间方面，《合同法》没有限制，规定发包人可随时行使。在行使权利的范围方面，包括作业进度和质量两方面。发包人对承包人作业进度的检查，一般依承包方提供的施工进度计划表、月份施工作业计划为据。检查、监督为发包人的权利，接受检查、监督便成为承包人的义务。对于发包人不影响其工作的必要监督、检查，承包人应予以支持和协助，不得拒绝。案例一 根据《合同法》规定，如果发包人对作业进度质量进行检查，妨碍了承包人正常作业，那么，承包人有权要求发包人承担由此造成的一切后果和损失；如果发包人的检查工作虽未妨碍承包人正常作业，但却超出了进度和质量两方面的范围限制，则承包人亦可拒绝接受检查，或要求发包人承担由此造成的损失。案例一 在本案中，房地产开发公司派专人检查工程施工进度的行为本身是行使检查权的表现。但是，检查人员的检查行为，已超出了法律规定的对施工进度和质量进行检查的范围，且以承包公司名义促使材料供应商提早供货，在客观上妨碍了承包公司的正常作业，因而构成权利滥用行为，理应承担损害赔偿责任。案例一 原告：某实业有限公司(简称甲方)被告：某建筑工程有限责任公司(简称乙方)案例二 一、基本案情2002年3月，甲乙双方施工总承包合同，由乙方负责某宿舍楼施工。双方在合同中约定：隐蔽工程由双方共同检查，相应检查费用由甲方支付。地下室防水工程完成后，乙方通知甲方检查验收，甲方则答复：因公司内事务繁多，由乙方自己检查出具检查记录即可。案例二 一周后，甲方又聘请专业人员对地下室防水工程质量进行检查，发现未达到合同所定标准，遂要求乙方负担此次检查费用，并对地下室防水工程返工。乙方则认为，合同约定的检查费用由甲方负担，不应由乙方负担此项费用，但对返工重修地下室防水工程的要求予以认可。甲方多次要求乙方付款未果，诉至法院。法院对地下室防水工程重新鉴定，鉴定结论为地下室防水工程不符合合同中约定的标准。法院据此判决由乙方承担复检支出费用。案例二 二、案例分析《合同法》规定：“隐藏工程在隐蔽以前，承包人应当通知发包人检查。发包人没有及时检查的，承包人可以顺延工程工期，并有权要求赔偿停工、窝工等损失。”隐蔽工程隐蔽以前，发包人的义务是及时对该隐蔽工程进行检查。如果没有履行这一义务或者没有及时履行这一义务，发包人应当承担因停工、窝工造成的损失。如果发包人不能及时履行检查义务的原因是承包人怠于通知，则所造成的损失由承包人自己承担。案例二 对承包人来说，隐蔽工程在隐蔽前，它首先有通知发包人检查的义务，如未履行这一义务，造成工程延期，承包人自己承担责任；其次，履行通知义务后，如发包人未履行及时检查义务，致使承包人不能进行隐蔽工程的隐蔽工作，则应当顺延工期，因顺延工期造成的停工、窝工损失，承包人有权要求发包人赔偿。第三，发包人未及时检查的，承包人可以停工待其检查，并有权要求发包人承担相应的违约责任。案例二 本案中，乙方履行了通知义务，对于甲方不履行检查义务的行为，乙方有权停工待查，停工造成的损失应当由甲方承担。但乙方未这样做，反而自行检查，并出具检查记录交与甲方后，继续进行施工。对此，双方均有过错。至于甲方的事后检查费用，则应视检查结果而定，如果检查结果是地下室质量未达到标准，那因这一后果是乙方所致，检查费用应由乙方承担；如果检查质量符合标准，重复检查的结果是甲方未履行义务所致，则检查费用应由甲方承担。案例二 原告：某建筑材料设备租赁站被告：某建筑工程总公司(简称建筑公司)案例三(简称租赁站) 一、基本案情1998年5月,被告建筑公司承包了某工程项目。被告就脚手架工程与原告租赁站签订分包合同，约定建筑公司以每平方米15元的造价，并以包工包料的方式将搭建脚手架工程分包给租赁站。至工程完工，租赁站共计完成搭架工程量5000平方米，合计工程款为75000元。案例三 但建筑公司仅支付工程款20000元，余款一直未付。2002年3月，租赁站将建筑公司告上法庭，要求该公司支付余款及违约金。建筑公司辩称，该公司与原告租赁站签订搭设脚手架合同后，双方于1998年11月另外签订了一份协议，明确约定:建筑公司给付租赁站20000元后，双方就不存在任何权利义务了。因此建筑公司要求法院驳回原告的诉请。案例三 二、案件审理一审法院经审理认为，原告租赁站与被告签订的搭设脚手架承包合同，是双方当事人真实意思的表示，应确认合法有效。签约后，原告实际完成的工程量经被告项目经理签字确认的是5000m2，但被告仅付20000元，拖欠余额支付属被告违约。对此，被告应给付该工程余款并承担延付该工程余款的违约金。案例三 同时，一审法院还认为，按照原告与被告在1998年11月签订的协议，原告放弃大部分工程款是不切实际的，故应确认该协议不是其真实的意思表示，依法应确认其无效。2002年8月，法院判决被告于判决生效后的十日内给付尚欠原告工程款55000元及延付该工程款的违约金，被告逾期付清的，则由被告按《民事诉讼法》的有关规定，向原告加倍支付延迟履行期间的债务利息。案例三 一审判决下达后，建筑公司不服并提出上诉。二审法院经审理后认为：虽然建筑公司与租赁站在1998年5月的合同中约定了脚手架以每平方米15元计算，而且建筑公司也签字确认了该工程量。但1998年11月双方再次达成协议，即：约定建筑公司给予租赁站20000元之后，双方之间的合同终止。同时，这个协议签订后，双方均履行了各自的义务。案例三 根据该协议，双方在履行了各自的义务后，就已经不存在债权债务关系了。如果被租赁站认为该协议显失公平，那么他应该在一年内向人民法院提出予以撤销的要求，而事实上租赁站直至2002年3月才提起诉讼，已超过法定时间，因此，租赁站要求建筑公司给付工程款是没有法律依据的。2002年11月，二审法院对该案做出改判：撤消一审法院的判决，驳回租赁站要求建筑公司支付工程欠款的诉讼请求。案例三 三、案例评析本案中的当事人对工程价款有过两次约定。《合同法》规定，当事人协商一致的，可以变更合同。后一个协议虽然明显不利于原告，但它毕竟是当事人双方协商一致的结果，具有变更原合同的法律效力。当事人双方的债权债务关系应当根据后一个协议重新确定。案例三 租赁站如果认为该协议显示公平，应当在法律规定的时效内(知道或者应当知道撤销事由之日起一年内)行使撤销权。但遗憾的是，租赁站并没有及时行使该项权利，其诉讼请求无法得到法律保护。案例三 原告：某建筑工程承包公司被告：某房地产开发公司案例四 一、基本案情2000年7月，原告某承包公司与被告某房地产公司与就某项目签订了一份前期工程协议书，双方约定:承包公司负责该项目的前期工程,包括动拆迁和七通一平,房地产公司按面积分四期支付工程款。案例四 在合同履行过程中，承包公司由于疏忽，对在项目基地红线边缘的两所协议规定应该拆除的民房未予以拆除。房地产公司虽然知道这个情况，但就是一直不予提醒，而且还不加说明地拒付了大部分工程款(因此还耽搁了一段时间的工期),这种状况一直延续至该项目完工。案例四 结算过程中，承包公司根据协议，要求房地产公司支付尚欠的2000万元工程款，但遭到了房地产公司的拒绝。理由是，承包公司没有按协议的约定完成任务，两所民房仍未拆除，而且还拖延了工期。2001年4月，无可奈何的承包公司只能以欠款为由，将房地产公司告上了法庭。案例四 庭审中，承包公司承认，这两所民房是双方协议规定应该拆除的，未予拆除的原因确实是承包公司的疏忽。但是，这两所民房未拆并未实际影响项目施工，现在工程已全部完工，房地产公司可以扣除这两所房子的拆迁费用，但不应拒付大部份的工程款；对此，房地产公司不但不予认可而且还提出反诉，要求承包公司支付延误工期的巨额违约金1000万元。案例四 二、案件审理2000年5月，法院经审理做出判决：承包公司应拆清剩余的2所民房；房地产公司则应按约支付全部工程款给承包公司。至于延误工期的违约金系由房地产公司拒付巨额工程款而造成，是房地产公司的人为原因使损失扩大，依法予以驳回。案例四 三、案例评析“全面履行”是合同当事人依法应当履行的基本义务，《合同法》规定：“当事人应当按照约定全面履行自己的义务。”承包公司没有按约定将应该拆除的民房拆除，就是没有“全面履行”，应当判令其全部完成。案例四 同时，法律又为当事人设定了“减损义务”，这是诚实信用原则的根本体现。《民法通则》规定：“当事人一方因另一方违反合同受到损失的，应及时采取措施防止损失的扩大；没有及时采取措施致使损失扩大的，无权就扩大的损失要求赔偿。”防止损失扩大是在合同履行过程中因某种原因致使当事人遭受损失，双方在有条件的情况下都有采取积极措施防止损失扩大的义务，而不管这种损失的造成与自己是否有关。案例四 房地产公司显然是属于在“另一方违反合同受到损失”时，没有及时采取措施防止损失的扩大。因此对于扩大了的损失，当然也就不能要求赔偿了。案例四 原告：某房地产公司被告：某设计公司案例五 一、基本案情房地产公司与设计公司签订了一份勘察设计合同，约定：设计公司为房地产公司筹建中的商业大厦进行勘察、设计，按照国家颁布的收费标准支付勘察设计费，并在2000年1月9日前提交勘察设计成果，合同还约定了双方的违约责任、争议的解决方式。案例五 同时，房地产公司与建筑公司签订了建设工程施工合同，在合同中规定了开工日期。不料，设计公司迟迟不能按约定的日期提交出勘察设计文件，而建筑公司已按施工合同的约定做好了开工准备，如期进驻施工场地。在房地产公司的再三催促下，设计公司迟延25天提交勘察设计文件，此时建筑公司已窝工18天。案例五 施工期间，建筑公司又发现设计图纸中的多处错误，不得不停工等候设计公司对图纸进行修改。建筑公司由于窝工、停工要求房地产公司赔偿损失，否则不再继续施工。房地产公司将设计公司诉至法院，要求设计公司赔偿损失。法院经审理支持了房地产公司的诉讼要求，判决设计公司应承担违约责任。案例五 二、案例分析《合同法》第280条规定：“勘察、设计的质量不符合要求或者未按照期限提交勘察、设计文件拖延工期，造成发包人损失的，勘察人、设计人应当继续完善勘察、设计，减收或者免收勘察、设计费并赔偿损失。”案例五 本案中，设计公司不仅没有按照合同的约定提交勘察设计文件，致使房地产公司的建设工期受到延误，造成建筑公司的窝工，而且勘察设计的质量也不符合要求，致使建筑公司因修改设计图纸而停工、窝工。设计公司的上述违约行为已给房地产公司造成了经济损失，使房地产公司的建设工期被延误，而且还赔偿原告窝工、停工的损失。因此，设计公司应当承担免收或减收勘察设计费并赔偿房地产公司损失的责任。案例五 2002年3月,某实业公司(简称甲方)与某建筑工程公司(简称乙方)签订施工总承包合同，由乙方负责某宿舍楼施工。合同约定：隐蔽工程由双方共同检查，检查费用由甲方支付。地下室防水工程完成后，乙方通知甲方检查验收，甲方称公司事务繁多，由乙方自己检查出具检查记录即可。一周后，甲方又聘请专业人员对地下室防水工程质量进行检查，发现未达到合同所定标准，遂要求乙方负担此次检查费用，并对地下室防水工程返工。课堂练习题--案例分析 乙方认为，合同约定的检查费用由甲方负担，不应由乙方负担，但对返工重修地下室防水工程的要求予以认可。问：(1)隐蔽工程隐蔽以前，发包人和承包人的义务是什么？(2)本检查费用由谁承担？课堂练习题--案例分析'