最新京都念慈庵蜜炼川贝枇杷膏限度操作的方案[1]课件PPT.ppt 62页

'京都念慈庵蜜炼川贝枇杷膏限度操作的方案[1] 一、试验材料1、供试品：150ml/瓶京都念慈庵蜜炼川贝枇杷膏〖成份〗　川贝母、枇杷叶、南沙参、茯苓、化橘红、桔梗、法半夏、五味子、瓜蒌子、款冬花、远志、苦杏仁、生姜、甘草、杏仁水、薄荷脑，辅料为：蜂蜜、麦芽糖、糖浆。〖性状〗　本品为棕褐色稠厚的半流体；具杏仁香气，味甜，辛凉。〖功能主治〗润肺化痰、止咳平喘、护喉利咽、生津补气、调心降火。本品适用于伤风咳嗽、痰稠、痰多气喘、咽喉干痒及声音嘶哑。〖包装〗　玻璃瓶装，每瓶装150毫升。 2、培养基：培养基可按以下处方制备，也可使用按该处方生产的符合要求的脱水培养基。配制后，应采用验证合格的灭菌程序灭菌。以下是本试验中要用到的培养基：1)营养肉汤培养基2)硫乙醇酸盐流体培养基3)改良马丁培养基4)玫瑰红钠琼脂培养基5)酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基（YPD）6)胆盐乳糖培养基（BL）7)乳糖胆盐发酵培养基8)曙红亚甲蓝琼脂培养基（EMB）9)8.4-甲基伞形酮葡糖苷酸（MUG）10)三糖铁琼脂培养基（TSI） 二盐酸二甲基对苯二胺N，N-dimethyl-p-phenylenediaminedihydrochloride【C8H12N2·2HCL=209.12】本品为白色或灰白色结晶性粉末；指控其中色渐变暗；易吸潮。在水或乙醇中溶解。溴化十六烷基三甲胺CetylTrimethymmoniumBromide【C19H42BrN=364.46】本品为白色结晶。在水中溶解，在乙醇中微溶，在乙醚中不溶。中性红NeutralRed【C15H17N4Cl=288.78】本品为深绿色或棕黑色粉末。在水或乙醇中溶解。牛肉浸出粉BeefExtracatPowder本品为米黄色粉末，在水中溶解。牛胆盐OxBileSalt本品为淡黄色或黄棕色粉末，味苦而甜，具吸湿性。在水或醇中易溶。 甘露醇Mannitol【C6H14O6=182.17】本品为白色结晶；无臭，味。在水中溶解，在乙醇中微溶。4-甲基伞形酮葡糖苷酸4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide，MUG【C18H16O9=376.3】本品为白色针状结晶。在水、乙醇或乙醚中溶解。在喜庆氧化钠溶液中分解。去氧胆酸钠SodiumDeoxycholate【C24H39NaO4=414.56】本品为白色结晶性粉末，味苦。易溶于水，微溶于醇，不溶于醚。亚碲酸钠SodiumTellurite【Na2TeO3=221.58】本品为白色粉末。在热水中易溶，在水中微溶。玫瑰红钠（四氯四碘荧光素钠）RoseBengalSodiumSalt【C20H2CL4I4Na2O5=1017.6】 本品为棕红色粉末，在水中溶解，溶液中呈紫色，无荧光；在硫酸中溶解，溶液为棕色。单硬脂酸甘油酯GlycerolMonostearte【C12H42O4=358.556】本品为白色或黄色蜡状。在热有机溶剂或矿物油中溶解，在水中不溶，但与水能乳化。枸橼酸钠SodiuCitrate【C6H5Na3O7·2H2O】本品为白色结晶或粉末。在水中易溶，在乙醇中不溶。枸橼酸铁按AmmoniumFerricCitrate【C12H22FeN3O14=488.16】本品为棕红色或绿色鳞片或粉末，易潮解，见光易还原成亚铁。在水中溶解，在醇或醚中不溶。 胰蛋白胨Tryptone本品为米黄色粉末。在水中溶解。硫酸锌ZincSulfate【ZnSO4·7H2O=287.56】本品为白色结晶、颗粒或粉末。在水中易溶，在甘油中溶解，在乙醇中微溶。硫酸锰ManganeseSulfate【MnSO4·H2O=169.02】本品为粉红色结晶。在水中溶解，在乙醇中不溶。酪蛋白胰酶消化物（胰酪胨或酪胨）PancreaticDigestofCasein本品为黄色或浅黄色颗粒。以干酪素为原料经胰酶水解、活性炭脱色处理、精致而成。 （3）指示剂中性红指示剂取中性红1.0g，研细，加95%乙醇60ml使溶解，加水至100ml。变色范围pH6.8~8.0（红→黄）。亚甲基蓝指示剂取亚甲蓝0.5g，加水使溶解成100ml。酚磺酞指示剂取酚磺酞1.0g，加1mol/L氢氧化钠溶液2.82ml，使溶解，再加水至100ml。变色范围pH6.8~8.4（黄→红）。溴甲酚紫指示液取溴甲酚紫1.6g，加95%乙醇使溶解成100ml。变色范围pH5.2~6.8（黄→紫）。曙红钠指示液取曙红钠2.0g，加水使溶解成100ml。 4、菌种：大肠埃希菌（Escherichiacoli）〔CMCC（B）44102〕金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）〔CMCC（B）26003〕枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）〔CMCC（B）63501〕白色念珠菌（Candidaalbicans）〔CMCC（F）98001〕黑曲霉（Aspergillusniger）〔CMCC（F）98003〕乙型副伤寒沙门菌（SalmonellaparatyphiB）〔CMCC（B）50094〕铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）〔CMCC（B）10104〕生孢梭菌（Clostridiumsporogenes）〔CMCC（B）64941〕 二、操作方法1、供试液的制备供试液从制备至加入检验用培养基，不得超过1小时。供试品40ml，取20ml加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至200ml，用匀浆仪或其他适宜的方法，混匀，作为1∶10的供试液；取1：10的供试液10ml用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100ml，混匀，作为1：100的供试液；取1：100的供试液10ml用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100ml，混匀，作为1：1000的供试液。其余20ml供试品直接用于沙门菌的检验。必要时加适量的无菌聚山梨酯80，并置水浴中适当加温使供试品分散均匀。 2、细菌、霉菌及酵母菌计数（1）计数培养基的适用性检查：细菌、霉菌及酵母菌计数用的培养基应进行培养基的适用性检查。①菌液制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基中，培养5～7天，加入3～5ml含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，用适宜方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05％（v/v）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数50～100cfu的孢子悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在2～8℃，在验证过的贮存期内使用。 ②适用性检查：取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌各1ml，分别注入无菌平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置30～35℃培养48小时，计数；取黑曲霉1ml，分别注入无菌平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数；取白色念珠菌1ml，注入无菌平皿中，立即倾注酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，平行制备2个平皿，混匀，凝固，置23～28℃培养72小时，计数。同时，用相应的对照培养基替代被检培养基进行上述试验。③结果判定：被检培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值大于70%，且菌落形态大小应与对照培养基上的菌落一致。判该培养基的适用性检查符合规定。 （2）计数方法的验证验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。（3）菌种及菌液制备同计数培养基的适用性检查①验证方法验证试验至少应进行3次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。试验组：平皿法计数时，取试验可能用的最低稀释级供试液1ml和50～100cfu试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，每株试验菌平行制备2个平皿，按平皿法测定其菌数。薄膜过滤法计数时，取规定量试验可能用的最低稀释级供试液，过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入50～100cfu试验菌，过滤，按薄膜过滤法测定其菌数。菌液组：测定所加的试验菌数。 供试品对照组：取1ml供试液，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。稀释剂对照组：若供试液制备需要分散、乳化、中和、离心或薄膜过滤等特殊处理时，应增加稀释剂对照组，以考察供试液制备过程中微生物受影响的程度。试验时，可用相应的稀释液替代供试品，加入试验菌，使最终菌浓度为每1ml供试液含50～100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。 ②结果判断:在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应均不低于70%。若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数；若任一次试验中试验组的菌回收率低于70%，应采用培养基稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。若没有适宜的方法消除供试品中的抑菌作用，那么验证试验中微生物回收的失败可看成是因供试品的抗菌活性引起的，同时表明该供试品不能被试验菌污染。但是，供试品也可能仅 对试验用菌株具有抑制作用，而对其他菌株没有抑制作用。因此，根据供试品须符合的微生物限度标准和菌数报告规则，在不影响检验结果判断的前提下，应采用能使微生物生长的更高稀释级的供试液进行方法验证试验。若验证试验符合要求，应以该稀释级供试液作为最低稀释级的供试液进行供试品检验。计数方法验证时，采用上述方法若还存在一株或多株试验菌的回收率达不到要求，那么选择回收情况最接近要求的方法和试验条件进行供试品的检验。 （4）供试品检查计数方法包括平皿法和薄膜过滤法（本试验采用的是平皿法）。检查时，按已验证的计数方法进行供试品的细菌、霉菌及酵母菌菌数的测定。按计数方法的验证试验确认的程序进行供试液制备。用稀释液稀释成1∶10、1∶102、1∶103等稀释级的供试液。取供试液1ml，置直径90mm的无菌平皿中，注入15～20ml温度不超过45℃的溶化的营养琼脂培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基，混匀，凝固，倒置培养。每稀释级每种培养基至少制备2个平板（计数时取平均值）。阴性对照试验，取试验用的稀释液1ml，置无菌平皿中，注入培养基，凝固，倒置培养。每种计数用的培养基各制备2个平板，均不得有菌生长。 一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下，若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果。本试验中所用供试品含蜂蜜，应用玫瑰红钠琼脂培养基测定霉菌数，用酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基测定酵母菌数，合并计数。 菌数报告规则细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300cfu、霉菌宜选取平均菌落数小于100cfu的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告1mL供试品中所含的菌数。如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。 4、控制菌检查（1）控制菌检查用培养基的适用性检查控制菌检查用的培养基应进行培养基的适用性检查，成品培养基、由脱水培养基或按培养基处方配制的培养基均应检查。检查项目包括培养基的促生长、指示和抑制特性能力。菌种对试验菌种的要求同计数培养基的适用性检查。菌液制备：接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基或营养琼脂培养基中，生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，培养18～24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基或改良马丁琼脂培养基中，培养24～48小时。用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。菌悬液在室温下放置应在2小时内使用，若保存在2～8℃可在24小时内使用。 控制菌检查培养基特性试验菌株大肠埃希菌胆盐乳糖培养基促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌MUG培养基促生长能力+指示能力大肠埃希菌曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂促生长能力+指示能力大肠埃希菌大肠菌群乳糖胆盐发酵培养基促生长能力大肠埃希菌抑制能力金黄色葡萄球菌乳糖发酵培养基促生长能力+指示能力大肠埃希菌曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂促生长能力+指示能力大肠埃希菌沙门菌营养肉汤促生长能力乙型副伤寒沙门菌四硫磺酸钠亮绿培养基促生长能力乙型副伤寒沙门菌抑制能力金黄色葡萄球菌胆盐硫乳琼脂或沙门、志贺氏属琼脂促生长能力+指示能力乙型副伤寒沙门菌曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂促生长能力+指示能力乙型副伤寒沙门菌适用性检查:控制菌检查用培养基的适用性检查所用的菌株及检测项目见表1 铜绿假单胞菌胆盐乳糖培养基促生长能力铜绿假单胞菌抑制能力金黄色葡萄球菌溴化十六烷基三甲铵琼脂促生长能力铜绿假单胞菌抑制能力大肠埃希菌绿脓菌素测定用培养基促生长能力+指示能力铜绿假单胞菌金黄色葡萄球菌亚碲酸盐肉汤培养基促生长能力金黄色葡萄球菌抑制能力大肠埃希菌卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇盐琼脂促生长能力+指示能力金黄色葡萄球菌抑制能力大肠埃希菌梭菌梭菌增菌培养基促生长能力生孢梭菌哥伦比亚琼脂促生长能力生孢梭菌白色念珠菌沙氏葡萄糖肉汤促生长能力白色念珠菌沙氏葡萄糖琼脂促生长能力+指示能力白色念珠菌念珠菌显色培养基促生长能力+指示能力白色念珠菌抑制能力大肠埃希菌吐温80玉米琼脂培养物促生长能力+指示能力白色念珠菌 增菌培养基促生长能力检查：分别接种不大于100cfu的试验菌（见表1）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌应生长良好。固体培养基促生长能力检查：取试验菌各0.1ml（含菌数50～100cfu）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。被检培养基与对照培养基生长的菌落大小形态特征应一致。培养基抑制能力检查：接种不少于100cfu的试验菌（见表1）于被检培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最长时间下培养，试验菌应不得生长。 固体培养基指示能力检查：取试验菌各0.1ml（含菌数不大于100cfu）（见表1）分别涂布于被检培养基和对照培养基平板上，在相应控制菌检查规定的培养温度及时间下培养。被检培养基中试验菌生长的菌落形态、大小、指示剂反应情况等应与对照培养基一致。液体培养基指示能力检查：分别接种不大于100cfu的试验菌（见表1）于被检培养基和对照培养基中，在相应控制菌检查规定的培养温度及最短培养时间下培养。与对照培养基管比较，被检培养基管试验菌生长情况、指示剂反应等应与对照培养基一致。 （2）控制菌检查方法的验证当建立药品的微生物限度检查法时，应进行控制菌检查方法的验证，以确认所采用的方法适合于该药品的控制菌检查。若药品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，检查方法应重新验证。验证时，依各品种项下微生物限度标准中规定检查的控制菌选择相应验证的菌株，验证大肠菌群检查法时，应采用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。菌种及菌液制备：同控制菌检查用培养基的适用性检查 验证方法取1ml供试液及1ml试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取1ml供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注入增菌培养基或取出滤膜接入增菌培养基中。结果判断若上述试验检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；若试验组未检出试验菌，应采用培养基稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新进行方法验证。 （3）供试品检查供试品的控制菌检查应按已验证的方法进行，增菌培养基的实际用量同控制菌检查方法的验证。阳性对照试验：供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为1ml，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。阴性对照试验：取稀释液10ml照相应控制菌检查法检查，作为阴性对照。阴性对照应无菌生长。 ①大肠埃希菌（Escherichiacoli）取供试液10ml（相当于供试品1ml），直接接种至100ml的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时，必要时可延长至48小时。取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5小时、24小时在366nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。 如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表2所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表2所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的鉴定试验，确认是否为大肠埃希菌。 表2大肠埃希菌菌落形态特征培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色，菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心，圆形，稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润，常有金属光泽麦康凯琼脂鲜桃红色或微红色，菌落中心呈深桃红色，圆形，扁平，边缘整齐，表面光滑，湿润 ②大肠菌群（Coliform）取含10ml的乳糖胆盐发酵培养基管3支，分别加入1∶10的供试液1ml（含供试品0.1ml）、1∶100的供试液1ml（含供试品0.01ml）、1∶1000的供试液1ml（含供试品0.001ml），另取1支乳糖胆盐发酵培养基管加入稀释液1ml作为阴性对照管。培养18～24小时。乳糖胆盐发酵管若无菌生长、或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠菌群；若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。若平板上无菌落生长，或生长的菌落与表3所列的菌落形态特征不符或为非革兰阴性无芽孢杆菌，判该管未检出大肠菌群；若平板上生长的菌落与表3所列的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。 表3大肠菌群菌落形态特征培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、紫红色、红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润麦康凯琼脂鲜桃红色或粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润确证试验从上述分离平板上挑选4～5个疑似菌落，分别接种于乳糖发酵管中，培养24～48小时。若产酸产气，判该乳糖胆盐发酵管检出大肠菌群，否则判未检出大肠菌群。 表4可能的大肠菌群数表根据大肠菌群的检出管数，按表4报告1ml供试品中的大肠菌群数。各供试品量的检出结果可能的大肠菌群数N（个/ml）0.1ml0.01ml0.001ml+++-++--+---＞103102＜N＜10310＜N＜10＜10注：+代表检出大肠菌群；-代表未检出大肠菌群。 ③沙门菌（Salmonella）取供试品10ml，直接或处理后接种至200ml的营养肉汤培养基中，用匀浆仪混匀，培养18～24小时。取上述培养物1ml，接种于10ml四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养18～24小时后，分别划线接种于胆盐硫乳琼脂培养基和麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时（必要时延长至40～48小时）。若平板上无菌落生长，或生长的菌落不同于表5所列的特征，判供试品未检出沙门菌。若平板上生长的菌落与表6所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选2～3个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种，培养18～24小时，如斜面未见红色、底层未见黄色；或斜面黄色、底层无黑色，判断供试品未检出沙门菌。否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的鉴定试验，确认是否为沙门菌。 表5沙门菌菌落形态特征培养基菌落形态胆盐硫乳琼脂无色至浅橙色，半透明，菌落中心带黑色或全部黑色或无黑色沙门、志贺菌属琼脂无色至淡红色、半透明或不透明，菌落中心有时带有黑褐色曙红亚甲蓝琼脂无色至浅橙色，透明或半透明，光滑湿润的圆形菌落麦康凯琼脂无色至浅橙色，透明或半透明，菌落中心有时为暗色 ④铜绿假单胞菌（Peudomonasaeruginosa）取供试液10ml（相当于供试品1ml），直接接种至100ml的胆盐乳糖培养基中，培养18~24小时。取上述培养物，划线接种于绣花十六烷基三甲胺琼脂培养基的平板上，培养18~24小时。铜绿假单胞菌典型菌落呈扁平、无定形、周边扩散、表面湿润，灰白色，周围时有蓝绿色素扩散。如平板上无菌落生长或与上述菌落形态特征不符，判断供试品未检出铜绿假单胞菌。如平板生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2~3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18~24小时。取斜面培养物进行革兰染色、镜检及氧化酶试验。氧化酶试验取洁净滤纸片置于平皿内，用无菌玻棒取斜面培养物涂于滤纸片上，滴加新配制的1%二盐酸二甲基对苯二胺试液，在30秒内若培养物呈粉红色并逐渐变为紫红色为氧化酶试验阳性，否则为阴性。 若斜面培养物为非革兰阴性无芽孢杆菌或氧化酶试验阴性，均判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素试验。绿脓菌素(Pyocyanin)试验取斜面培养物接种于PDP琼脂培养基斜面上，培养24小时，加氯甲烷3~5ml至培养管中，搅碎培养基并充分振摇。静置片刻，将三氯甲烷相移至另一试管中，加入1mol/L盐酸试液约1ml，振摇后，静置片刻，观察。若盐酸溶液呈粉红色，为绿脓菌素试验阳性，否则为阴性。同时用未接种的POP琼脂培养基斜面同法作阴性对照，阴性对照试验应呈阴性。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，判供试品检出铜绿假单胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性，应继续进行适宜的鉴定试验，确认是否为铜绿假单胞菌。 表6金黄色葡萄菌菌落形态特征⑤金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）取供试液10ml（相当于供试品1ml），直接接种至100ml的亚碲酸钠肉汤培养基中，培养18~24小时，必要时可延长至48小时。取上述培养物，划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养24~72小时。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表6所列特征，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。培养基菌落形态甘露醇氯化钠琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有黄色环，菌落直径0.7~1mm卵黄氯化钠琼脂金黄色，圆形凸起，边缘整齐，外围有卵磷脂分解的乳浊圈，菌落直径1~2mm 若平板上生长的菌落与表7所列的菌落特征相符或疑似，应挑选2~3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18~24小时。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰染色，并接种于营养肉汤培养基中，培养18~24小时，作血浆凝固酶试验。血浆凝固酶试验：取灭菌小试管3支，各加入血浆和无菌水混合液（1：1）0.5ml，再分别加入可疑菌株的营养肉汤培养物0.5ml、金黄色葡萄球菌营养肉汤培养0.5ml、营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml，即为试验管、阳性对照管和阴性对照管。将3管同时培养，3小时后开始观察直至24小时。阴性对照管的血浆应流动自如，阴性对照管血浆应凝固，若试验管血浆凝固者为血浆凝固酶试验阳性，否则为阴性。如阳性对照管或阴性对照管不符合规定时，应另制备血浆，重新试验。若上述疑似菌为非革兰阳性球菌、血浆凝固酶试验阴性，判供试品未检出金黄色葡萄球菌、 ⑥梭菌（Clostridium）取供试液10ml（相当于供试品1ml）2份，其中1份置80℃保温10分钟后迅速冷却。上述2份供试液直接或处理后分别接种至100ml的梭菌増菌培养基中，置厌氧条件下培养48小时。取上述每一培养物0.2ml，分别涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，置厌氧条件下培养48~72小时。若平板上无菌落生长，判供试品未检出梭菌；若平板上有菌落生长，应挑选2~3个菌落分别进行革兰染色和过氧化氢酶试验。过氧化氢酶试验：取上述平板上的菌落，置洁净玻片上，滴加3%过氧化氢试液，若菌落表面有气泡产生，为过氧化氢酶试验阳性，否则为阴性。若上述可疑菌落为革兰阳性梭菌，有或无卵圆形或球形的芽胞，过氧化氢酶阴性，判供试品检出梭菌，否则判供试品未检出梭菌。 ⑦白色念珠菌（Candidaalbicans）取供试液10ml（相当于供试品1ml）直接接种至100ml的沙氏葡萄糖肉汤培养基中，培养48~72小时。取上述培养物划线接种于沙氏葡萄糖琼脂培养基平板上，培养24~48小时（必要时延长至72小时）。白色念珠菌在沙氏葡萄糖琼脂培养基上生长的菌落呈乳白色偶见淡黄色，表面光滑有浓酵母气味，培养时间稍久则菌落增大，颜色变深、质地变硬或有褶皱。若平板上无菌落生长或生长的菌落与上述菌落形态特征不符，判供试品未检出白色念珠菌。如平板上生长的菌落与上述菌落形态特征相符或疑似，应挑选2~3个菌落分别接种至念珠菌显色培养基平板上，培养24~48小时（必要时延长至72小时）。若平板上无绿色或翠绿色的菌落生长，判供试品未检出白色念珠菌。 若平板上生长的菌落为绿色或翠绿色，挑取相符或疑似的菌落接种于1%吐温80-玉米琼脂培养基上，培养24~48小时。取培养物进行染色，镜检及牙管试验。牙管试验:挑取1%吐温80-玉米琼脂培养基上的培养物，接种于加有一滴血清的载玻片，盖上盖玻片，置湿润的平皿内，置35~37℃、1~3小时，置显微镜下观察，可见到由孢子长出短小芽管。若上述疑似菌为非革兰阳性菌，显微镜未见厚膜孢子、假菌丝、芽管，判供试品未检出白色念珠菌。 三、结果判断供试品间隙控制菌或其他致病菌时，按一次检出结果为准，不再复试。供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数其中任何一项不符合该品种项下的规定，应从同一批样品中随机抽样，独立复试两次，以3次结果的平均值报告菌数。若供试品的细菌数、霉菌和酵母菌数、控制菌三项检验结果符合该品种项下的规定，判断符合规定；若其中任何一项不符合该品种项下的规定，判供试品不符合规定。限度标准细菌数，每1ml不得过100cfu。霉菌和酵母菌数，每1ml不得过100cfu。大肠埃希菌，每1ml不得检出。每10ml还不得检出沙门菌。 基本农田调查的相关政策及工作方法北京市国土资源局海淀分局资源规划科二OO八年三月二十五日 一、相关政策工作目标依据我区土地利用总体规划(2001-2010)，按照基本农田保护划定和调整资料，将基本农田保护地块落实至土地调查数据库中，统计汇总出各级行政区域内基本农田的分布、面积、地类等状况，并登记上证、造册。 调查内容与及范围调查内容：2004年土地利用总体规划已划定的基本农田位置、面积和分布状况以及基本农田范围内的地类状况。调查范围：责任状和规划图的并集，即责任状或规划图为基本农田的地块均做调查。调查涉及单位：温泉镇、西北旺镇、苏家坨镇、上庄镇。 工作方法一、工作底图准备搜集基本农田划定的图件数据；(市局)依法调整补划的图件数据；(市局、分局)技术单位逐图斑录入2004年基本农田责任状划定的基本农田，生成与责任状对应的基本农田图，与规划图、集体土地调查图、遥感影象图进行叠加，制作工作底图，提取相关数据信息。(由市局统一委托技术单位)负责搜集经批准调整补划的基本农田具体地块资料；(分局) 工作方法二、内业判读组织调查人员和乡镇工作人员，根据反馈底图和数据，按照要求，组织进行内业判读与核查，填写相关表格； 1.2004年基本农田调查表有记录，2001年土地利用现状图上没有相应图斑，无法落图的权属代码村名基本农田保护图斑预编码2001年土地利用现状图斑基本农田图斑界线不确定图文一致性检查集调一致性检查备注无3责任状档案号基本农田调查表落图 2.责任状净面积=本图斑划入基本农田面积：直接复制到工作底图中，不需要填表3.责任状净面积>本图斑划入基本农田面积：该图斑部分划入基本农田，打破01年图斑，编辑形成2004年基本农田保护图斑，不需要填表基本农田责任状面积 4.责任状净面积>本图斑划入基本农田面积，对应01年图斑完全落在规划图中基本农田保护区内的5.责任状净面积>本图斑划入基本农田面积，对应01年图斑完全落在规划图中基本农田保护区外的权属代码村名基本农田保护图斑预编码2001年土地利用现状图斑基本农田图斑界线不确定图文一致性检查集调一致性检查备注080603000700214.内080600400800325.外 图文一致性：规划图中基本农田没有，而责任状中有的填写”1”;规划图中基本农田有，而责任状中无的填写“2”。集调一致性检查基本农田保护图斑，在北京市集体土地调查数据库为非农用地，在“集调一致性检查”中填写“1”(集调为农用地代码：01耕地、02园地、03林地、041天然牧草地、042人工牧草地、104农村道路、114坑塘水面、117沟渠、122设施农用地、123田坎) 工作方法三、外业调查对于内业难以确定的相关调查内容，根据数据检查表和基本农田调查工作底图，以基本农田责任状为依据，国土分局组织乡镇和外业测绘队伍进行核实，并确定基本农田保护图斑的准确界线。并填写基本农田现状调查表 工作方法四、基本农田上图原则：将基本农田保护图斑图层与第二次土地调查（本次调查）中的利用现状图进行套合，与行政界、权属界和土地利用现状图斑界线不吻合的基本农田保护图斑，以土地利用现状图为准，进行调整。以便最终确定基本农田的准确界线，形成两者相匹配的基本农田数据。 具体处理：1.当基本农田地块数据与土地利用现状数据库中图斑的空间位置、形状、地类基本一致，只是由于纠正、投影转换、比例尺不同导致的位移，其处理方法为直接从土地利用现状数据库中提取图斑作为基本农田保护图斑数据。2.基本农田保护图斑数据与土地利用现状数据库中图斑的空间位置基本一致，但图斑有部分边界形状、地类发生变化。其处理方法是从土地利用现状数据库中提取相同或吻合的图斑边界部分，与原基本农田图斑的边界进行结合，重新生成新的基本农田保护图斑。 3.当基本农田图斑包含多个土地利用现状图斑，或基本农田图斑覆盖土地利用现状图斑99%以上面积，或与土地利用现状图斑界线位移不超过1mm时（当比例尺不同时，按小比例尺的一方进行计算），以土地利用现状图斑界线为依据，调整基本农田图斑与土地利用现状图斑一致。4.当基本农田保护图斑界线与土地利用现状图斑界线位移超过1mm，且基本农田图斑覆盖该土地利用现状图斑的面积<99%时，依据基本农田保护图斑界线破土地利用现状图斑，并进行外业核实。 5.对于基本农田数据的比例尺小于或者等于土地利用现状数据，而使得基本农田保护图斑界线与土地利用现状图斑界线相差较大或者出现明显不符的情况时（如图斑形状、地类都不相符），需要区县国土分局组织相关调查人员进行实地核实，确定基本农田的准确界线，形成准确的基本农田数据。6.部分基本农田规划图上行政界、权属界线、街坊（村界）与土地利用现状数据库中行政界、权属界线、街坊（村界）走向不一致，导致基本农田的位置和形状对应关系不正确，应当随同有关部门外业实地进行核实，情况属实的要重新分割、合并基本农田保护图斑，并重新进行基本农田保护图斑编码。 工作方法五、数据建库(分局配合技术单位)六、成果汇总七、调查报告编写 其他说明1、全市基本农田调查工作利用2006年集体土地地籍调查成果开展，待本市第二次土地调查工作完成后，再利用其成果进行基本农田调查成果的更新，即全市基本农田现状的认定严格以本市第二次土地调查成果为依据，以避免工作的重复。2、按照国家土地调查办的有关规定，在基本农田调查后期内业数据处理阶段，需依据本市第二次土地调查成果中的行政边界和图斑边界，对原基本农田图斑边界进行技术调整，即调整之后的全区基本农田面积将与责任状签订的面积存在较小差异。'