最新凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量课件PPT.ppt 44页

'凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量 实验目的掌握凝胶层析的基本原理。学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。 实验原理凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。 仪器和试剂仪器：层析柱、恒流泵、紫外检测仪、自动部分收集器试剂待测样品：胰岛素、牛血清白蛋白蓝色葡聚糖2000；SephardexG-75；洗脱剂 实验步骤1．凝胶溶胀凝胶颗粒要求大小比较均匀，可流速稳定，结果较好。取葡聚糖SephardexG-75干粉，加过量的蒸馏水室温充分溶胀一天（溶胀时间因凝胶交联度不同而不同），或沸水浴中溶胀3小时，这样可大大缩短溶胀时间，而且可以杀死细菌和霉菌，并可排出凝胶内气泡。溶胀过程中注意不要过分搅拌，以防颗粒破碎。待溶胀平衡后用倾泻法除去不易沉下的细小颗粒，最后凝胶经减压抽气除去气泡，即可准备装柱。 2.装柱与平衡装柱前须将凝胶上面过多的溶液倾出，将层析柱垂直装好。关闭出口，向柱管内加入约1/3柱容积的洗脱液，然后在搅拌下，将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉降约2—3cm后，打开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱，关闭出水口。装柱要求连续、均匀、无气泡、无“纹路”。将洗脱剂与恒流泵相连，恒流泵出口端与层析柱相连。通过2—3倍柱床容积的洗脱液使柱床平衡，然后在凝胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时凝胶被冲起，并始终保持凝胶上端有一段液体。 3.上样与洗脱样品上柱是实验成败的关键之一，若样品稀释或上柱不均，会使区带扩散，影响层析效果。上样时应尽量保持床面的稳定。先打开柱的出口，待柱中洗脱液流至距床表面1～2mm时，关闭出口，用滴管将1ml样品慢慢地加至柱床表面，应避免将床面凝胶冲起，打开出口并开始计算流出体积，当样品滲入床中接近床表面1mm时关闭出口。按加样操作，用少量（约1ml）洗脱液冲洗管壁2次。最后加入少量洗脱液于凝胶上，使高出床表面3～5cm，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连通恒流泵，调好流速，以每管3ml/10min流速开始洗脱。上样的体积，分析用量为柱床容积的1—2%；制备用量为柱床容积的20%~30%。 4.收集与鉴定用自动部分收集器收集流出液，每管4ml，紫外检测仪280nm波长处检测，最高的一个OD值时的体积即为吸收峰的洗脱体积Ve。5．凝胶柱的处理凝胶用过后，反复用蒸馏水洗后保存，如果有颜色或比较脏，可用0.5mol/LNaCl洗涤。短期可保存在水相中，加入防腐剂或加热灭菌后于低温保存。建议长期用干燥状态保存。 计算分子量的测定和计算，一般都采用标准曲线法。只要测得几种标准蛋白质相对分子质量的Ve，并以它们的相对分子质量的对数(logMr)对Ve作图得一直线，再测出待测样品的Ve，即可从图中确定它的相对分子质量。 注意事项各接头不能漏气，连续用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。注意恒压瓶内的排气管应无液体，并随着柱下口溶液的流出不断有气泡产生，则表示恒压瓶不漏气。操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。 思考题生化实验中常用的凝胶有哪些种类？各有何特点？凝胶层析除用于测定蛋白质相对分子质量外，还有何用途？比较电泳和层析测定蛋白质相对分子质量的差异。你认为本实验的关键在哪里？上样前为什么要将柱中多余液体放出？ 高压电子循经点穴笔 高压电子循经点穴笔作用一、接通经络网、输送信息穴位是接受信息的窗口，经络是传播信息的通路。一般人因气血循经“传导”的信息较弱，或因信息“传导”过程中受各种因素的干扰而不为觉察感知。本点穴疗法确有疏通经络网，调和气血等作用，气血运行传导是客观存在的，经脉，络脉和穴位，彼此紧密相连；纵横交错，形成网络，共同完成运行气血任务，所以说经络有“行血气、通阴阳、善脏腑、濡筋骨、利关节”等作用，从而使人体内外环境保持阴阳平衡，保证机体正常的生命活动。 整体观念调整机体平衡阴阳标本兼治高压电子循经点穴笔，是将高科技电子技术运用于医学领域、融中医针灸、推拿按摩、指压穴位、反射疗法、神经反射疗法等具有多种自然疗法和物理疗法特色的人能电能的综合疗法。临床实用性更强，经长期的临床实践，循经点穴疗法尤其对神经系统、循环系统、心血管系统、呼吸系统、运动系统和免疫系统的疾病有较为显著的治疗与康复保健作用，并对一些疑难病症如头痛、头晕、关节疼痛、椎基动脉供血不足，高血压等病症往往可以收到较好的治疗效果。 三、调整经络功能作用经络是祖国传统医学生理学概念，是指人体内经脉与脉络的总称。由于经络具有联络脏腑肢节，沟通上下，内外，调节各部组织功能和运行全身血气等功能。因此，无论人体脏腑、气血、肢节等任何系统有病，都会通过经络的作用而反应于人体相关体表组织与腧穴，高压电子笔循经点穴疗法则根据经络的这一生理，病理特点，采用循经点穴的治疗方法，根据“经络所通、主治所及”的原理，进行循经取穴施治，达到疏通和调节经络功能的作用。 四、对脏腑、气血作用传统医学认为，人体是以五脏六腑为本，以经络、气血为用、人体脏腑、经络、气血、四肢百骸、五官九窍、皮肉筋骨相互联系，相互为用，构成了一个完整的有机体。因此，无论脏腑，气血任何一方功能失调，均可相互影响而破坏人体健康状态。如心脾两虚或脾肾虚，均可导致气血两虚，而气血两虚也可导致心、脾、肾的功能失调。高压静电电子笔是根据这一生理，病理特点，在辨证与辨病施治基础上，采用循经点穴手法达到益气活血，调整脏腑功能的作用。 五、对筋骨关节作用在生活中，外伤与劳损是较为常见的疾病。如各种直接或间接的局部扭伤、纤维破裂、肌腱撕脱、关节脱位等。这些病症的主要症状是肿、痛。这主要是受伤局部肌肉痉挛，劳损部位血供不足，局部循环代谢障碍等致使代谢物质沉积，组织缺氧及炎症反应以及损伤后导致组织粘连，劳损造成软组织纤维化等。高压电子循经点穴对症治疗，可改善局部循环、使周围组织、神经、血管解除紧张痉挛、促进组织修复、而达到活血化瘀，消肿止痛，舒经活络，松解粘连、灵利关节等作用。 六、对呼吸系统的作用高压电子循经点穴疗法通过刺点夹脊穴、膀胱经及肺俞、定喘、风门、大抒、风池、天柱、迎香、曲池、气海等相关经络，腧穴，脉点，可达到益气固表，宣肺理气等作用以及增强横隔运动和呼吸运动，加强肺的通气、换气功能，解除支气管痉挛，支气管内膜的血管收缩，使渗出减少，及时参与呼吸调节的中枢结构等都有明显的影响，因此，高压静电电子循经点穴疗法对过敏性哮喘、慢性支气管炎、过敏性鼻炎、感冒和提高呼吸系统免疫力等方面，均有较好的预防和保健治疗作用。 七、对循环系统的调节作用高压电子循经点穴对人体头颈部、背部、腹部及四肢经络、腧穴、脉点及面部刺点，可产生益气活血、化瘀除痹等作用，及解除肌肉、神经、血管紧痉挛、使周围血管开放，毛细血管扩散，血流旺盛，和对人体血液流量、流速、流态产生调整等作用。这主要是刺点部位生物物理和生物化学的变化——轴突反射、植物神经及其介质等神经一体液调节，而对循环系统产生调节作用。 因此，高压电子循经点穴疗法不但可以对人体心率、心律产生明显的条件作用，而且对脑血管循环、四肢末梢循环等人体循环系统有较明显的调节改善作用。对高血压、脑血管病、心动过速、心律不齐、静脉炎、末梢循环障碍等有较好的治疗作用。 八、对神经系统作用高压电子循经点穴可调节恢复神经血管功能，促进细胞代谢，提高细胞含氧量，增强细胞活性，改善脑部供血、供氧状态。调节大脑皮层的电荷运动趋向同步化，改善血管微循环，调节中枢神经功能等作用，同时，选择不同穴位及配穴，即可降低交感神经的兴奋性，又可提高交感神经的兴奋性，并可恢复神经传导功能等。因此，高压电子循经点穴疗法对脑性瘫痪、神经麻痹、神经性头痛、失眠、美尼氏综合症、重症肌无力、椎一动脉供血不足，老年性痴呆等病症均有较好的调治作用。 九、对免疫系统的作用高压电子循经点穴的疗效，可调整人体阴阳，调和营卫、气血、强健脏腑组织功能，增强机体的抗病能力，以及使机体细胞免疫力提高，血脑——垂体——肾上腺皮质系统的内分泌功能有所改善，可降低机体过敏状态，保持机体内、外环境的稳定状态，从而增强机体的免疫功能。因此，循经点穴对过敏性疾病、组织变态性反应有一定的调节作用。 十、对内分泌系统的作用人体内分泌系统是受神经或神经一体液调节的控制。高压电子笔循经点穴疗法对内分泌的治疗机理是通过对人体有关经络线、脉点、固定位的刺激、对神经神经一体液产生调节治疗作用。因此，该法对糖尿病、更年期综合症、甲状腺功能亢进等内分泌系统病症均有一定的调节作用。 适应症（1）内科病症：偏头痛、紧张性头痛、外伤性头痛、神经衰弱、失眠、哮喘、慢性支气管炎、胃、十二指肠炎、消化不良、膈肌痉挛、便秘、颈肩综合症、椎一基动脉供血不足等。（2）外科病症：对神经麻痹症、脑损伤后遗症、肌萎缩症、急慢性软组织损伤、颈椎病、重症肌无力、偏瘫、面瘫、肱骨内、脊椎病、腰肌劳损、关节疼痛等。（3）妇、儿科疾病：子宫功能性出血、经前期紧张综合症、月经不调、痛经、小儿脑瘫、消化不良、夜啼、遗尿、小儿发育迟缓、假性近视等。 （4）五官科疾病：美尼氏综合症、神经性耳聋、耳鸣、过敏性鼻炎、牙痛等。（5）其他：阳痿、早泄、不育症、老年痴呆症、大脑疲劳、晕动症等。 注意事项（1）学习了解人体生理解剖和中医基础理论知识及高压静电对人体产生的生物学效应。（2）在循经点穴之前，先嘱咐病人静坐在≥9000伏高压静电电容电极软垫上15-20分钟，再用1000-2500伏高压电子笔循经刺点治病脉点和穴位及刺点十二经脉的五腧穴（井、荥、经、输、合）。 （3）在循经刺点穴位中，如出现异常反应，应停止刺点，对症处理。（4）刺点穴位有补法和泻法，一般的说，轻刺为补，重刺为泻；阴经穴用补法，阳经穴用泻法。 负电位 负电位的功能负电位是在高压电位的基础上，经过技术手段控制而形成的负电位场。作用人体后，可以让人体正电荷不规则运动进行重新排列。A.负电位可以平衡人体的酸碱度B.促进人体新陈代谢；促进伤口愈合；促进细胞生成SOD延缓衰老；C.促进神经细胞的活跃和调节神经功能，缓解机体疲劳和肌肉疼痛； 人出生时就带有约5V左右的电能量，电能量使心脏跳动，维持机体的正常运行。体内没有电能量时，心脏停止跳动。地球上存在的电，按其物理特性可区分为正电和负电。根据正电和负电的流量，人的心情也有所不同。现代人生活在无数公害的时代，所有环境逐渐脱离自然。人类食用的水和粮食以及接触外部的所有物质，其中带电的物质正逐步消失。带正电的氧.二氧化碳.氢等物质却越发活跃。电位是带电荷的一种电能量，其中呈（+）的是正电位，呈（-）的是负电位。人体同时存在正电位和负电位。正电多的人免疫力弱，易得慢性病，属酸性体质;负电位多的人细胞活跃，免疫力强，属弱碱性体质。 （1）负电位对人体的影响1.正常细胞以细胞膜为界，细胞膜外是正电位，内为负电位。因负电位始终多于正电位产生的差，将细胞内生成的有害物质排除体外（细胞膜通透性好）2.堆积过多的非正常细胞构造的正电位，导致细胞呼吸作用底下，细胞膜外的正电位高于负电位，细胞内疲劳物质等无法排除体外，生物体节奏被打破，细胞组织失去活力；3.病变部位组织和器官，正电位自然升高影响气电流，导致体能底下，对人体产生不良影响； （1）负电位对人体的影响4.气电力的指在体内细胞膜利用正电位和负电位，使每个细胞产生电，从而维持36.5度体温的力量；5.若体内缺少负电位，会导致自律神经失调，更年期障碍以及高血压，动脉硬化，脑卒中，心脏病，神经痛，肝功能下降，肠胃病，还会出现雀斑，细纹等老化现象；6.体内缺少负电位导致纤毛运动弱化，呼吸时无法排除有害气体。缺少负电位影响全身氧气的供应，导致不安，失眠，眩晕，情绪不稳，记忆力及耐力下降，神经质。 （2）负电位的七大作用人的健康血液是弱碱性你身体的，可是日常生活中产生的压力会让身体酸化。负电位可以调整血液里的钠离子和钙离子，让酸性化的身体转为弱碱性以调整体质，其作用犹如森林浴，让身心从新振作起来。根据日本医学报告指出—负电位可以将多数疾病加以改善，尤其是现代人易患的各种慢性疾病，拥有卓越的预防和治疗效果。其主要作用如下： 1.促进新陈代谢，增强人体免疫力当体内负电位增加时，因细胞膜电性物质的交流让细胞活化，使各种营养素被细胞充分吸收，而细胞中老旧的废物可完全排出，增进新陈代谢，毒素被排出体外，自然健康有活力。 2.净化血液，改善动脉硬化预防和治疗心脑血管疾病负电位可使血液中的钙离子，钠离子比例上升，加速血液弱碱化进程，血液成弱碱性可减少胆固醇等废物粘在血管壁上，光滑血管壁；排出血液里的各种毒素。对预防和治疗高血压，糖尿病，动脉硬化，脑中风，心肌梗死等心脑血管疾病有很大的功效。 3.调整自律神经自律神经是控制人体所有内脏，血管，内分泌等我们意识无法控制的神经，是维持生命不可或缺的基本机能，如此重要的神经机能会吸收负电位而获得平衡（正负交感神经达到平衡状态），连带与自律神经有密切关系的内分泌功能也会顺畅，对于现代人不断增加的自律神经失调症（例如失眠，便秘，神经痛，气喘，肺炎，肺气肿，支气管炎，耳鸣，心神不宁，头晕脑胀，生理不顺等），皆有很好的功效。 4.促进酵素活性化，减轻肝脏负担肝脏所产生的酵素是维持生命活动不可或缺的重要物质，而酵素的活性化与否又取决于血液的酸碱性，因负电位可净化血液，进而促使酵素活性化，大大减轻肝脏负担。有效的预防肝炎，肝腹水，肝硬化，肝癌的发生。 5.促进胃肠蠕动负电位可促进胃肠蠕动，并使肠内酵素活性化，不但可以防止肠内细菌异常滋生，更可以保持肠胃畅通，改善便秘，肠胃不适的困扰。对治疗和预防胃肠疾病（如胃炎，胃溃疡，十二指肠溃疡，胃痛，胃胀，胃口不好，肠炎，肠梗阻等）有很好疗效 6.止痛消炎，加速伤口愈合负电位能量对于一般外伤伤口，血流不止或身体各种疼痛，都有消炎，退肿，抑制疼痛，加速伤口愈合，加快止血速度等功效 7.净化空气，犹如森林浴使用负电位能量的同时，增加室内负离子含量，具有净化室内空气，舒畅身心等功效 总之经过临床验证和实际体验者的情况反馈，有下述状况者：高血压，低血压，高血脂，中风后遗症，动脉硬化等心脑血管疾病；风湿性关节炎，骨质增生，骨质疏松，坐骨神经痛等骨关节及软组织疾病；糖尿病，尿频尿急，便秘，食欲不振等内分泌系统混乱。肾病，前列腺疾病，妇科疾病及消化系统疾病；自律神经失衡所引起的失眠，健忘，神经衰弱，头晕，头痛，易疲劳等疾病；免疫力，抵抗力低下的亚健康人群及中老年人群；追求靓丽，欲美容瘦身的爱美人士等有很好的确切的疗效。'