最新分解纤维素的微生物的分离课件PPT.ppt 63页

'分解纤维素的微生物的分离 本节课标：1.简述纤维素酶的种类及作用。2.学习从土壤中分离出分解纤维素的微生物的方法。3.谈论这类微生物的应用价值。2 纤维素是地球上含量最丰富的多糖类物质，是天然有机高分子化合物：自然界中纤维素含量最高的天然产物是棉花，含量达92％～95％，亚麻达80％，此外木材、作物秸秆也富含纤维素。许多商品纤维素都是由天然纤维素制得：如水溶性的羧甲基纤维素钠（CMC---Na）；不溶于水的微晶纤维素等食品添加剂。①纤维素含量一、基础知识1、纤维素3 纤维素酶不是单一酶，是复合酶，包括C1酶、CX酶、葡萄糖苷酶。C1酶：(外切酶)从糖链的末端开始切掉两个葡萄糖分子，产生纤维二糖。葡萄糖苷酶：将纤维二糖分解为葡萄糖CX酶：(内切酶)作用于糖链的内部使之断裂成糖链片段。7 A、人能不能对纤维素消化吸收？为什么？答：不能，因为人体不能合成纤维素酶。人以淀粉为主要的能量来源。③思考：B、食物中的纤维素有什么作用？答：食物中的膳食纤维可刺激胃肠蠕动和分泌消化液，有助于食物的消化和排泄。8 C、反刍动物能利用纤维素吗？为什么？答：能，在反刍动物的瘤胃中生活着大量可以分解纤维素的微生物，能产生大量的纤维素酶9 方法：滤纸崩溃法3、纤维素酶活性的测定实验：10 11 A、①②③④⑤B、②③⑤C、②③④⑤D、③⑤C下列生物能分解纤维素的是（）①人②兔③牛④蘑菇⑤纤维杆菌12 二、纤维素分解菌的筛选2、筛选原理：1、筛选方法：刚果红染色法刚果红（CR）是一种染料，它可以与象纤维素这样的多糖物质形成红色复合物，但并不和水解后的纤维二糖和葡萄糖发生这种反应3、筛选过程：13 通过产生的透明圈来筛选纤维素分解菌加入刚果红红色复合物红色复合物无法形成出现以纤维素分解菌为中心的透明圈纤维素被分解纤维素14 15 4、纤维素分解菌的选择培养基和鉴别培养基①纤维素分解菌的选择培养基16 答：液体培养基，因培养基中无凝固剂，利用液体培养基培养以增加纤维素分解菌的浓度B、培养基具有选择作用的原因答：能够产生纤维素酶的微生物才能分解纤维素作为碳源和能源，并大量繁殖；不能分解纤维素的微生物由于缺乏碳源受到抑制而不能正常生长繁殖，因此培养基具有选择作用A、物理性质上看选择培养基的类型及原因思考：17 C、你能否设计一个对照实验，说明选择培养基的作用？答：用牛肉膏蛋白胨培养基与其对照D、为什么选择培养能够“浓缩”所需的微生物？答：在选择培养的条件下，可以使那些能够适应这种营养条件的微生物得到迅速的繁殖。而那些不适应这种营养条件的微生物的繁殖被抑制，因此可以起到浓缩的作用。18 ②纤维素分解菌的鉴别培养基19 三、实验设计1、实验流程20 ①分布环境（1）土壤取样：富含纤维素的环境中2、操作步骤由于生物与环境的相互依存关系，在富含纤维素的环境中，纤维素分解菌的含量相对提高，因此从这种土样中获得目的微生物的几率要高于普通环境。②原因21 ③实例：树林中多年落叶形成的腐殖土，多年积累的枯枝败叶等。④讨论:如果找不到合适的环境，可以将滤纸埋在土壤中，将滤纸埋在土壤中有什么作用？你认为滤纸应该埋在土壤中多深？答：将滤纸埋在土壤中能使纤维素分解菌相对集中，实际上是人工设置纤维素分解菌生存的适宜环境。一般应将滤纸埋于深约10cm左右的土壤中。22 （2）选择培养①目的：增加纤维素分解菌的浓度，以确保能够从样品中分离所需要的微生物②操作：称取土样20g，在无菌条件下加入装有30mL培养基的摇瓶中。将摇瓶置于摇床上，在30℃下振荡培养1～2d，至培养基变混浊。吸取一定的培养液（约5mL），转移至另一瓶新鲜的选择培养基中，以同样的方法培养到培养液变浑浊。23 （3）梯度稀释：吸取上清液1mL富集后的培养液，注入盛有9mL的无菌水的无菌大试管中，充分混匀；然后再用一只1mL无菌吸管从此试管中吸取1mL注入另一盛有9mL无菌水的试管中，依次等比稀释至106稀释度。（4）涂布培养将鉴别培养基平板分别标号，分别将稀释度为106～104的菌悬液各取0.1mL，对号滴加到鉴别培养基平板，并用涂布器均匀涂布。将培养基平板于300C倒置培养,至菌落长出。每个稀释度下需涂布3个平板24 1、刚果红染色法:（5）筛选菌株：常用的刚果红染色法有两种，一种是先培养微生物，再加入刚果红进行染色反应，另一种是在倒平板时就加入刚果红方法一：在长出菌落的培养基上，覆盖质量浓度为1mg/ml的CR溶液，10～15分钟后，倒去CR溶液，加入物质量浓度为1mol/L的NaCL溶液，15分钟后倒掉NaCL溶液，此时，产生纤维素酶的菌落周围就会出现透明圈。①方法25 方法二：配制质量浓度为10mg/mL的CR溶液，灭菌后，按照每200mL培养基加入1mL的比例加入CR溶液，混匀后倒平板。等培养基上长出菌落后，产生纤维素酶的菌落周围将会出现明显的透明圈26 在产生明显的透明圈的菌落，挑取并接种到纤维素分解菌的选择培养基上，在300C－370C培养，可获得纯培养。2、挑菌27 四、课题延伸本课题对分解纤维素的微生物进行了初步的筛选。但是这还只是分离纯化的第一步为确定得到是纤维素分解菌，还需要进行发酵产纤维素酶的实验，纤维酶的发酵方法有液体发酵和固体发酵两种。1、固体发酵：指微生物在没有或几乎没有游离水的固态的湿培养基上发酵的过程。例：农村的堆肥、青饲料和做酒曲。28 2、液体发酵：呈液体的微生物发酵过程。现代微生物工业多为液体发酵，因适用面广，可精确调控、效率高、可机械化和自动化。3、纤维素酶的测定一般是对纤维素酶分解滤纸等纤维素后所产生的葡萄糖进行定量的测定4、葡萄糖的测定葡萄糖分子结构中含有还原性基团，可与斐林试剂发生作用，生成砖红色沉淀。29 1、刚果红是一种酸性染料，能将下列哪些物质染色（）①纤维二糖②葡萄糖③纤维素④苏木精⑤弹性纤维B、①②③A、①③④C、②③④D、③④⑤D2、分离土壤中纤维素分解菌用到的方法（）①稀释倒平板法②涂布平板法③单细胞挑取法④选择培养基法A、①②B、①②③④C、②③D、①③④B30 请用流程图总结出分离微生物的一般方法：土壤取样选择培养（此步是否需要，应根据样品中目的菌株数量的多少来确定）梯度稀释将样品涂布到有特定鉴别作用的培养基上挑选单菌落发酵培养31 咳嗽 病名咳嗽是指肺失宣降，肺气上逆，发出咳声，或咳吐痰液的一种肺系病症。为肺系疾病的主要症候之一。就症状而论，有声无痰为咳，有痰无声为嗽。临床上往往痰声并见，难以截然分开，故以咳嗽并称。 沿革«内经»对咳嗽的成因、症状及证候分类、病理转归及治疗等进行了较为详细的论述。咳嗽之名始见于《素问•阴阳应象大论》：“秋伤于湿，冬生咳嗽”。《素问·咳论》提出了“五脏六腑皆令人咳，非独肺也”的观点。《诸病源候论·咳嗽候》有十咳之称，除五脏咳外，尚有风咳、寒咳、久咳、胆咳、厥阴咳等。《景岳全书·咳嗽》中，首次执简驭繁地把咳嗽归纳为外感、内伤两大类，论述了外感咳嗽和内伤咳嗽的病理过程，丰富了辨证论治的内容。 在分类上，有繁有简，明李挻以因分证，《医学入门》曰咳嗽诸证，有风嗽、寒嗽、湿嗽、热嗽、郁嗽、劳嗽、食积嗽、气嗽、痰嗽、干嗽、血嗽、酒嗽、久嗽、夜嗽、天行嗽共15种；张景岳在《景岳全书》中提纲挈领提出咳嗽一证，“诸家立治太繁、以余观之，止惟二证，一曰外感，一曰内伤，而尽之矣。”以后医家多拥景岳之说，如叶天士亦云“咳嗽一证，有外感内伤之分，阴阳虚实之别。” 在病机上，《医贯》指出咳嗽与肺脾肾的关系，并强调肾的重要。提出“金实不鸣，金破亦不鸣”。《医学入门》提出咳嗽与瘀血的关系，云“瘀血则喉间常有腥气……肺胀满，即痰与瘀血碍气”。《医门法律》提出秋燥之说，制清燥救肺汤治燥热伤肺所致之干咳喘逆。 在辨证上，明戴复庵曰“风寒嗽者，鼻塞声重恶寒；火嗽者有声少痰面赤；劳嗽者，盗汗出多做寒热，肺胀嗽者，动则喘窒重；湿嗽者嗽动便有痰声，痰出嗽止。”张景岳曰：“外感之嗽其来暴；内伤之嗽其来徐。”清张璐曰“一嗽痰即出者，脾湿胜而痰滑也。连嗽十数声，痰不即出者，肺燥胜而痰涩也。”这些至今辨证时仍在沿用。 在治疗上，叶氏《临证指南医案》有咳为气逆，嗽为有痰，内伤外感之因甚多，不离乎肺脏为患，若因于风者，辛平解之；因于寒者，辛温散之，因于暑者，当与微辛微凉，苦降淡渗；因于湿者，有兼风、兼寒、兼热之不同，以理肺治胃为主；若因秋燥，则喻氏之义最精；因于火者，以甘寒为主。至于内因为病，有刚亢之威、木扣而金鸣者，当清金制木，佐以揉肝入络；若土虚而不生金，真气无所禀摄者，有甘凉，甘温二法。又因水虚痰泛，元海竭而诸气上冲者，则有金水双收，阴阳并补之治，或大剂滋镇摄，保固先天一炁元精。至于饮邪致嗽，另有专门、兼参可也。 病因病机外感：六淫之邪，从口鼻或皮毛而入，肺卫受侵，肺气壅遏不宣，清肃失常，痰液滋生，阻塞气道，引起咳嗽。刘完素《素问病机气宜保命集•咳嗽论》云“寒暑燥湿气火六气，皆令人咳嗽” 病因病机内伤：总由脏腑功能失调，内邪干肺所致，可分肺脏自病或他脏病及于肺。《素问·咳论》“五脏六腑皆令人咳，非独肺也”1、肺脏虚弱因肺脏自病者多由肺原发疾病迁延不愈，肺脏虚弱，阴伤气耗，肺的主气功能失常，宣肃无权，气逆为咳。2、痰湿蕴肺饮食伤脾，运化不健，痰浊内生，上干于肺致咳；3、肝火犯肺肝郁气滞，郁而化火，熏灼肺脏，炼液为痰，痰火犯肺，引起咳嗽；4、肾脏亏虚肾气衰弱，气失摄纳，气化无权，水渍泛溢于肺，而发咳嗽。 诊断1、咳逆有声或伴喉痒咯痰。2、外感咳嗽多起病急，病程短，常伴恶寒发热等表证；内伤咳嗽多为久病，常反复发作，病程较长，常伴有其他脏腑失调的表现。听诊可闻及两肺呼吸音增粗，或伴有干湿啰音。血常规化验，胸部X线检查等，有助于诊断。 类证鉴别外感咳嗽与感冒：外感咳嗽虽有风寒、风热、风燥之别，但总以咳嗽为主证，而风寒、风热之感冒则以发热、恶寒、身痛等表证为主证，咳嗽只是一兼见症状。 类证鉴别1、内伤咳嗽与痰饮证：痰湿咳嗽当与饮证之饮犯胸肺及痰证之痰浊壅肺区别。此三者病机虽相似，但病情则有差别。饮犯胸肺及痰浊壅肺两证就全身症状而论远较痰湿咳嗽为重，其病程亦较之为长。饮犯胸肺者因肺气上逆，咳喘胸满，不能平卧，痰多白沫；痰浊壅肺可有热痰、湿痰、燥痰之不同，咳嗽喘满，气促不安。 类证鉴别2、肺虚咳嗽当与肺痨、肺痿相鉴别：严格讲肺痨、肺痿均属肺虚咳嗽之中，然肺痨咳嗽以咳嗽伴有消瘦、咳血、潮热、盗汗为特征，而肺阴虚咳嗽不一定都是肺痨；肺痿是因肺脏的慢性虚损所致的肺叶痿弱不用。临床以咯吐唾沫为主症，咳嗽并非必见。无论虚寒或虚热肺痿病情均较重，且病程长。 类证鉴别3、与喘证鉴别喘证也可以兼有咳嗽症状，但是主要以呼吸困难，甚则张口抬肩，鼻翼煽动，不能平卧为特征。咳嗽日久不愈，可转变为喘证。4、与肺胀鉴别肺胀是多种慢性肺系疾病反复迁延而致，除咳嗽症状外，并有胸部膨满，喘咳上气，烦躁心慌，甚则肢体浮肿，面色晦暗等，病机为肺脾肾功能失调，痰浊、水饮与瘀血互结，病情缠绵，经久难愈。 辩证要点1、辨内伤外感：外感咳嗽多起病急，病程短，咳嗽之外兼有表证，属实证，治宜疏邪，宜通肺气，忌收敛。内伤咳嗽多起病慢，病程长，除咳嗽外兼脏腑内伤之证，属虚实夹杂或虚证，治宜按标本虚实调理脏腑、健脾、清肝、补肾，忌过辛散。 辩证要点2、辨寒热虚实：外感咳嗽以风寒、风热、风燥为主---多属实。内伤咳嗽痰湿痰热、肝火---多属实或虚实并见。从痰及咳而辨从四个方面进行。①痰之有无、性状、色泽、痰质稀稠、量之多少，有无气味。痰之有无：干咳无痰属燥属火。气味：痰甜为脾热；痰酸辣为肝气犯肺；痰咸为肾虚水泛。有痰又当详辨如下： 辨痰见图↗稀泡沫→风燥伤肺或风寒伤肺↗色白→粘泡沫→风热伤肺痰少↘色黄→粘稠→热伤肺（虚热或实热内伤或外感）↘粘块→老痰热甚或津亏（内伤多）↗水泡→痰湿阻肺↗色白→清稀→寒痰水饮阻肺痰多↘粘稠→寒湿有化热之势↘↗稀→湿热或风热色黄→粘稠→热伤肺（虚热或实热）↘脓样→火热伤肺（实热） 辨证要点②辨咳嗽声音：咳声重浊---多属风寒或夹湿；咳声粗亢---多属风热；咳声嘶哑---多属燥热；咳声如串、阵作---多属肝胆火旺；咳声低弱无力，时作时止，断续而咳---内伤，肺阴不足或肺气虚弱。 辨证要点③辨咳嗽发作时间：咳嗽新发，日夜不休---为外感；久咳绵绵不止---为内伤；冬重夏轻，遇风寒加重---为寒或阳虚；夏秋加剧---多为暑热秋燥。平旦咳多---内有痰饮。上午咳重---多胃中有火。午后咳重---为阴虚。 辨证要点④辨咳嗽兼夹症：咳而喉痒---多兼风邪；咳而多尿---见于肾气不固；咳兼骨蒸潮热颧红---为阴虚火旺。咳而疲极---兼气虚。咳声频连---多为燥热或肝火。 分型论治外感咳嗽1、 风寒袭肺症状：咳嗽新起，咳声重浊，痰稀色白，气急，常伴头痛鼻塞，流清涕，咽痒，肢体酸楚，恶寒发热，无汗等表证，舌苔薄白，脉浮或浮紧。治法：疏风散寒，宣肺止咳。方药：三拗汤合止嗽散加减。 分型论治2、风热犯肺症状：咳嗽频剧，咳声粗亢，咽喉疼痛，咳痰不爽，痰粘稠色黄，常伴有发热恶风，头痛汗出，口渴思饮，鼻流黄涕等表证，舌苔薄黄，脉浮数或浮滑。治法:疏风清热，宣肺化痰。方药：桑菊饮加减。 分型论治3、风燥伤肺症状：干咳喉痒，咳声嘶哑，无痰或痰少粘稠难出，或痰中带血丝，多伴有鼻咽干痛。发热。恶风。身痛等表证。舌尖红，苔薄黄而干，脉浮数或小数治法：疏风清肺，润燥止咳方药：桑杏汤加减 分型论治内伤咳嗽：1、痰湿蕴肺症状：咳嗽反复发作，咳声重浊，痰多易出，痰白粘稠，因痰而嗽，痰出咳平，胸脘痞闷，呕恶，食少，神疲乏力，大便时溏，舌苔白腻，脉濡滑。治法：健脾燥湿，化痰止咳方药：二陈汤合三子养亲汤加减 分型论治2、痰热郁肺症状：咳嗽气息粗促，痰多稠黄，咯吐不爽，喉中有痰声，或咯痰有腥臭味，胸胁引痛或身热面赤，口干欲饮，舌质红，苔薄黄腻，脉滑数。治法：清热化痰，肃肺止咳方药：清金化痰汤加减 分型论治3、肝火犯肺症状：上气咳逆，阵咳无痰或少痰，咳引胸胁胀痛，面赤喉干，口干而苦，症状可随情绪波动而增减，舌边尖红，苔薄黄少津，脉弦数治法：清肺泻肝，化痰止咳方药：泻白散合黛蛤散加味 分型论治4、肺阴亏耗症状：久咳干咳，咳声短促，痰少粘白或痰中夹血，或声音逐渐嘶哑，口干咽燥，午后潮热，颧红盗汗，手足心热，心烦失眠，神疲消瘦，舌质红，少苔，脉数或细数。治法：滋阴润肺，化痰止咳方药：沙参麦冬汤加减 治咳六法—宣降温清润敛1、“宣”：宣法指用宣散发表，宣疏肺气，以及宣郁理气、宣通壅滞等方药治疗咳嗽的方法。常用药物一般有麻黄、桂枝、杏仁、荆芥、苏叶、防风、桔梗、牛蒡子、射干、马勃等。2、“降”：降法指用肃降肺气，降气化痰，降火肃肺、肃肺祛瘀等方药治疗咳嗽的方法。常用药物一般有苏子、杏仁、桃仁、旋复花、白前、沉香、半夏、枇杷叶、瓜蒌、槟榔、莱菔子、葶苈子、青朦石等。 3、“温”：温法指用温肺理气，温肺化痰，温阳化饮，温中化痰，温肾纳气等方药治疗咳嗽的方法。常用药物一般有白芥子、干姜、桂心、薤白、附子等。4、“清”：清法指用清肺化痰，清肺泻火，清暑益肺等方药治疗咳嗽的方法。常用药物一般有桑皮、栀子、生石膏、寒水石、黄芩、知母、青黛、滑石、板蓝根、大青叶、鱼腥草、锦灯笼等。 5、“润”：润法是运用生津润肺、滋阴润肺，润燥化痰等方药治疗咳嗽的方法。常用药物一般有麦冬、沙参、阿胶、天冬、梨及梨皮，生地、元参、杏仁泥、柿霜等。6、“敛”：敛法是用敛肺补气，敛肺化痰等方药治疗咳嗽的方法。常用药物一般有五味子、乌梅、马兜铃、柯子、白果、白芨等。 思考题1、咳嗽的基本病因、病机是什么？为什么内伤咳嗽的主要病理因素为“痰”与“火”？2、如何辨别外感咳嗽与内伤咳嗽？3、咳嗽治疗原则是什么？为何故治疗咳嗽不能单纯地“见咳止咳”？4、风寒、风热、风燥咳嗽，痰湿蕴肺、痰热郁肺、肝火犯肺、肺阴亏耗等证候的主症、治法、主方是什么？如何加减变化？ 课后参考学习1、中华医学会呼吸病学分会哮喘学组．咳嗽的诊断与治疗指南(2009版)．中华结核和呼吸杂志．2009：32（6）2、慢性咳嗽病中医诊疗方案（试行）.24个专业105个病种中医诊疗方案.国家中医药管理局医政司.2011年'