最新血红蛋白的分离和提取课件PPT.ppt 53页

'血红蛋白的分离和提取 思考：“课题1--DNA的粗提取与鉴定”实验理想的材料是什么？“课题3--血红蛋白的提取和分离”这实验理想的材料又是什么？原因是？答：鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取，哺乳类动物成熟的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。 一、基础知识：（一）蛋白质分离原理（二）蛋白质分离的方法1）凝胶色谱法：又称分配色谱法2）电泳法（三）缓冲液的作用 3、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，（）的蛋白质容易进入凝胶内部的通道，路程（），移动速度（），而（）的蛋白质无法进入凝胶内部的通道，只能在（）移动，路程（），移动速度（），相对分子质量不同的蛋白质因此得以分离。相对分子质量较小较长较慢相对分子质量较大凝胶外部较短较快总结：大分子经过路程短，流动快；小分子经过路程长，流动慢。 洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液，促使蛋白质分子的差速流动。混合物上柱洗脱大分子流动快小分子流动慢收集大分子收集小分子4、具体过程 2．凝胶电泳法：1）原理：不同蛋白质的带电性质（正电荷或负电荷）、电量、分子形状和大小不同，在电场中受到的作用力大小、方向、阻力不同，导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同。2）影响蛋白质分子运动速度的因素电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 3）常用电泳方法琼脂糖凝胶电泳聚丙酰胺凝胶电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在测定蛋白质分子量时通常用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，使用时可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳做对照，根据两者的电泳区带位置，利用相关计算公式算出相对分子量SDS带负电荷多的，因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷的差别，使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 影响蛋白质分子运动速度的因素决定运动方向决定运动速率电荷性质电荷量分子形状分子大小√√√√ 由弱酸和相应的强碱盐溶解于水中。如H2CO3/NaHCO3，NaH2PO4/Na2HPO4等缓冲溶液－－洗脱剂（1）作用：（2）配制：抵制外界酸碱对溶液pH的干扰而保持pH稳定。（3）在血红蛋白的提取和分离实验中用的缓冲液的原因？目的是利用缓冲液模拟细胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结构和功能。 血液组成成分阅读思考：血液由______和________两部分组成。血细胞中________细胞数量最多，细胞的含量最高的化合物是_____________。该化合物是由_____________和____________构成的，其中每个亚基中都含有一个能与O2和CO2结合的______________________基团。血浆血细胞红细胞血红蛋白2条α-肽链2条β-肽链亚铁血红素 1.洗涤红细胞阅读思考：洗涤的目的是什么？洗涤的方法是什么？洗涤干净的标志是什么？血液100mL3g柠檬酸钠低速短时间离心红细胞血浆吸出血浆红细胞5倍体积生理盐水搅拌10min重复洗涤3次，直至上清液没有黄色 2.释放血红蛋白阅读思考：释放血红蛋白过程中，在洗涤好的红细胞加入了哪些物质，有什么用？目的分析：蒸馏水的作用是______________________________。加入甲苯的作用是____________________________。充分搅拌的目的是____________________________。使红细胞大量吸水胀裂溶解红细胞的细胞膜加速红细胞的破裂 滤纸过滤脂类物质3.分离血红蛋白分离过程红细胞混合液高速离心10min离心管烧杯有机溶剂血红蛋白 20mmol/L磷酸缓冲液4.透析血红蛋白透析的目的是什么？1mL1mL1mL去除血红蛋白中的小分子杂质 纯化－－凝胶色谱法1.凝胶色谱柱的制作：2.凝胶色谱柱的装填：教材图5－193.样品的加入和洗脱 注意：（1）凝胶颗粒＋蒸馏水→充分溶胀；凝胶装填时尽量紧密；装填时不能有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。（2）装完后，立即用缓冲液洗涤，使凝胶装填紧密 3.样品的加入和洗脱1.调液面2.加样4.洗脱5.收集缓冲液凝胶注意：洗脱过程不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重新填装。3.再调液面1.调液面2.加样3.再调液面4.洗脱、5.收集 注意事项1.红细胞的洗涤：洗涤次数不能过少；低速、短时离心。2.凝胶的预处理：沸水浴法，还能除去微生物和气泡3.色谱柱的装填：装填尽量紧密；无气泡；洗脱液不能断流。4.色谱柱成功标志：红色区带均匀一致地移动。Why？ 知识总结血红蛋白的提取和分离蛋白质分子的差异性凝胶色谱法原理分离过程凝胶电泳法缓冲溶液组成作用蛋白质的提取分离样品处理粗分离纯化纯度鉴定 1、用凝胶色谱法分离蛋白质的过程中，关于蛋白质的叙述，正确的是A、相对分子质量较小的蛋白质行程大于相对分子质量较大的蛋白质B、相对分子质量较小的蛋白质行程小于相对分子质量较大的蛋白质C、相对分子质量较小的蛋白质行程等于相对分子质量较大的蛋白质D、二者根本无法比较练习巩固 2.相对分子质量不同的蛋白质在凝胶中的进行过程可表示为图中哪一个B 3.凝胶色谱法分离蛋白质时，凝胶的种类较多，但其作用的共同点是()A.改变蛋白质分子通过凝胶时的路径B.吸附一部分蛋白质，从而影响蛋白质分子的移动速度C.将酶或细胞固定在凝胶中D.与蛋白质分子进行化学反应，从而影响其移动速度4.在利用凝胶电泳法分离蛋白质时，一定要加入缓冲液，其作用主要是()A.使酶的活性最高B.使蛋白质的活性最高C.维持蛋白质所带的电荷D.使蛋白质带上电荷AC 5、使用SDS-聚丙烯酰胺电泳过程中，不同蛋白质的电泳迁移率完全取决于A电荷的多少B分子的大小C肽链的多少D分子形状的差异 6.下列是有关血红蛋白提取和分离的相关操作，其中正确的是（）A．可采集猪血作为实验材料B．用蒸馏水重复洗涤红细胞C．血红蛋白释放后应低速短时间离心D．洗脱液接近色谱柱底端时开始收集流出液A 8.在装填凝胶柱时，不能有气泡存在的原因是A、气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果B、气泡阻碍蛋白质的运动C、气泡与蛋白质发生化学反应D、气泡在装填凝胶的时候，使凝胶不紧密 9.样品的加入和洗脱的操作不正确的是A、加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面B、加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内C、等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口D、用吸管小心的将1ml透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面 中医儿科学第八章传染病第八节百日咳 ［概述］一、定义；百日咳是小儿时期感受百日咳时邪（百日咳杆菌）而引起的肺系传染病，临床以阵发性痉挛性咳嗽和痉咳末伴有较长的鸡鸣样吸气性吼声为特征。中医学以其咳嗽特征称之为“顿嗽”、“顿呛”，又因其具有传染性，故又称为“疫咳”、“天哮呛”。二、发病情况：1、季节：本病一年四季均可发生，但以冬春季节多见。2、年龄：５岁以下婴幼儿最易发病，年龄愈小，病情大多愈重，10岁以上儿童较少发病。新生儿亦有发病。 ［概述］3、特点：①小儿肺常不足，易于感受百日咳时邪，本病病程较长，如不及时治疗，可持续2～3个月以上。②重症或体弱婴儿因体禀不足，正气亏虚，若痰热壅盛，闭阻于肺，易并发肺炎喘嗽；③痰热内陷心肝，则可致昏迷、抽搐之变证。④近年来，广泛开展百日咳菌苗预防接种，百日咳发病率已大为降低，⑤临床由副百日咳杆菌、腺病毒等病原引起的百日咳综合征仍较常见，两者症状相似，后者相对较轻，辨证论治的方法则基本相同。 [病因病机]本病病因为感受百日咳时邪所致。百日咳时邪侵入肺系，夹痰交结气道，导致肺失肃降，肺气上逆为其主要病因病机。百日咳病变脏腑以肺为主，初犯肺卫，继则由肺而影响肝、胃、大肠、膀胱，重者可内陷心肝。 [病因病机示意图]时邪→侵入肺系→肺失宣肃风寒风热初咳期痰热互结痰浊痰火痉咳期邪恋正虚肺阴亏虚肺脾气虚恢复期 [临床诊断]㈠诊断要点⒈根据流行病史，未接种百日咳菌苗，有百日咳接触史。⒉临床表现：诊断应注意几个特殊症状、体征；发病初期感冒症状逐渐减轻，而咳嗽反增；阵发性痉咳，咳嗽末有鸡鸣样吸气性回声，日轻夜重；面目浮肿，目睛出血，舌系带溃疡等。 [临床诊断]㈠诊断要点⑴初咳期：①自发病起至出现痉咳止，约１～2周。②初似感冒，发热，咳嗽，流涕及喷嚏等。③约2～3天后热退涕消，咳嗽加重，呈阵发性痉挛性咳嗽。⑵痉咳期：①痉咳期，持续2～4周或更久，阵发性、痉挛性咳嗽。②每次咳嗽十数声或数十声不止，咳末有鸡鸣样吸气性回声。③痉咳可见面赤引胁，颈引舌伸，屈肘握拳，涕泪相交。④痉咳眼胞浮肿，目睛出血，或舌下系带溃疡。⑤痉咳呈日轻夜重，可因烟雾刺激,情绪及气温骤变等诱发。⑥新生儿呛咳憋气，唇青面紫，惊厥抽搐，无典型痉咳。 [临床诊断]㈠诊断要点⑶恢复期：①痉咳停止，约2～3周。阵咳减少，咳嗽减轻，逐渐痊愈。②病愈后，因烟熏、冷空气等刺激或感冒时，又可引起痉咳。⑷患儿合并肺炎，脑病。好发于年幼、病重及体弱儿童。①肺炎：多因合并细菌感染。发热不退，咳嗽气促，呼吸困难、口唇发绀；肺部可闻及湿性啰音，或呼吸音减低等。②脑病：百日咳杆菌内毒素引起中毒性脑病，出现脑水肿。病程中因痉咳剧烈，脑缺血缺氧或脑出血，致抽搐昏迷。 [临床诊断]㈠诊断要点⒊实验室检查⑴血象：初咳期末及痉咳期白细胞总数升高，可达(20～40)×109/Ｌ，淋巴细胞升高，可达60％～80％。并发肺炎者，白细胞总数增加，淋巴细胞相对减少。⑵细菌培养：用咳碟法或鼻咽拭子法作细菌培养，有百日咳杆菌生长。在疾病第１周阳性率高达90%，以后降低。⑶荧光抗体检查：鼻咽拭子涂片作直接荧光抗体染色阳性。该法具有阳性率高、特异性强和诊断快速等优点。⑷血清学检查：用酶联免疫吸附试验检查血清中PT、FHA特异性抗体，其中IgG-PT最有早期诊断价值。 [临床诊断]㈡鉴别诊断⑴支气管炎与肺炎：有时也可有痉挛性咳嗽，但多在起病后几日内出现，咳后无鸡鸣样吸气声；肺炎患儿无淋巴细胞明显增多，肺部有中细湿啰音，胸片有肺部炎性改变。⑵百日咳综合征：副百日咳杆菌及腺病毒、呼吸道合胞病毒等均可引起类似百日咳的痉挛性咳嗽，称为百日咳综合征。主要依靠病原体分离或血清学检查进行鉴别。 [辨证论治]1．辨证要点百日咳可按初咳期、痉咳期、恢复期分阶段辨证。⑴初咳期邪犯肺卫辨风寒、风热。咳嗽痰稀色清、鼻流清涕者为风寒；咳嗽痰黄稠粘、鼻流浊涕者为风热。⑵痉咳期痰阻肺络辨痰火、痰浊。痉咳痰稠难咯、目赤舌红为痰火伏肺；痉咳痰稀易咯、舌淡苔白为痰浊阻肺。⑶恢复期邪去正伤，辨阴虚、气虚。干咳痰少、音哑低热口干为阴虚；咳而无力、痰稀自汗神疲为气虚。 [辨证论治]2．治疗原则⑴本病为痰气交阻，肺气上逆，其治在涤痰清火，泻肺降逆。初咳期以温散祛寒宣肺、疏风清热宣肺为主法；痉咳期以涤痰降气、泻肺清热为主法；恢复期以养阴润肺、益气健脾为主法。⑵本病主证虽呛咳不已，但不可妄用止涩之药，防留邪为患。⑶痉咳期痰火证居多，不可早用滋阴润肺之品，以防痰火不清，病程迁延难愈。 [辨证论治]3．证治分类（1）邪犯肺卫（初咳期）（2）痰火阻肺（痉咳期）（3）气阴耗伤（恢复期） [辨证论治]㈢证治分类（1）邪犯肺卫（初咳期）证候：本病初起，咳嗽喷嚏，鼻塞流涕，发热2～3天后咳嗽日渐加剧；日轻夜重，痰稀量少，或痰稠难咯，咳声不畅，未现典型痉咳；舌苔薄白或薄黄，脉浮。治法：疏风祛邪，宣肺止咳。方药：三拗汤（《太平惠民和济局方》）加味。常用麻黄辛温宣肺；甘草佐麻黄辛甘发散肺卫之邪；杏仁、瓜蒌皮、浙贝化痰止咳；桑叶、紫菀、枇杷叶宣肺止咳。加减：偏风寒者，加苏叶、百部、陈皮辛温宣肺化痰；痰多色白者，加半夏、茯苓、枳壳燥湿化痰止咳；偏风热者，加菊花、连翘、黄芩祛风清热宣肺；痰黄而粘稠者，加胆南星、鲜竹沥、黛蛤散清化痰热。 [辨证论治]（1）邪犯肺卫（初咳期）辨证分析：本证见于起病后１周，有外感咳嗽症状，数天后外感症状减而咳嗽加重，连声咳嗽，日轻夜重，应考虑为本病。辨其寒热，风寒犯肺者鼻流清涕，咳痰清稀易咯；风热犯肺者鼻流浊涕，咳嗽痰黄稠粘。本证以风热犯肺或风寒化热者居多。 [辨证论治]㈢证治分类（2）痰火阻肺（痉咳期）证候：咳嗽日轻夜重，伴鸡鸣声，吐出痰涎，痉咳暂缓。痉咳可因进食、刺激性气味、情绪激动易引起发作。痉咳可伴目睛红赤，两胁作痛，舌系带溃疡。舌质红赤，舌苔薄黄，脉数有力。治法：泻肺清热，涤痰镇咳。方药：桑白皮汤（《景岳全书》）合葶苈大枣泻肺汤（《金匮要略》）加减。常用桑白皮、黄芩、鱼腥草、浙贝母清泄肺热，化痰止咳；葶苈子、苏子、胆南星降逆化痰；前胡、杏仁、百部肃肺止咳；黄连、栀子泻火泄热。加减：痉咳频作者，加僵蚕、蜈蚣解痉镇咳；痰热闭肺，治宜开肺清热、涤痰定喘，选用麻杏石甘汤加味；窒息紫绀时紧急予以吸痰、吸氧。邪陷心肝，泻火涤痰，熄风开窍，选用羚角钩藤汤，神清搐止继治百日咳。 [辨证论治]（2）痰火阻肺（痉咳期）辨证分析：本证发病第2周始，可持续2～6周，呈阵发性痉咳。痉咳期痰火证为多，痉挛性咳嗽、痰稠难咯、舌红为特征；痰浊证以痉咳阵作、痰稀色清易咯、舌淡苔白为特征。时邪郁热，熏肺炼液为痰，痰火交结，肺失宣肃，且病涉他脏。痉咳不止，肺气上逆，胃失和降；痉咳连作，目睛出血，是肺热痰阻，肝火上炎；痉咳频频，胁肋胀痛，是肺失肃降，肝气横逆；痉咳久发，舌系溃疡，是痰火阻肺，心火上炎。 [辨证论治]㈢证治分类（3）气阴耗伤（恢复期）证候：痉咳缓解，干咳无痰，低热颧红，烦躁不宁，盗汗口干；舌红，苔少或无苔，脉细数。咳声无力，痰白清稀，神倦气短，纳少自汗，大便不实；舌淡，苔薄白，脉细弱。治法：养阴润肺，益气健脾。方药：肺阴亏虚证用沙参麦冬汤（《温病条辨》）加减。常用沙参、麦冬、玉竹、石斛润养肺阴；桑叶、花粉、冬花、川贝润肺；芦根、甘草生津利咽。肺脾气虚证用人参五味子汤（《幼幼集成》）加减常用参术苓草健脾；五味子敛肺；百部、白前宣肺。加减：咳嗽时作，加桔梗、杏仁宣肺止咳；干咳无痰，加百合、阿胶、生地润肺止咳；痰稀量多，加半夏、陈皮燥湿化痰。 [辨证论治]（3）气阴耗伤（恢复期）辨证分析：气阴耗伤见于病之后期。肺阴亏虚者，多由痉咳期邪热痰火熏肺，肺之阴津耗伤，肺燥咽喉失濡，故证候以干咳少痰、声音嘶哑、低热盗汗、烦躁少宁、舌红苔少为特征。肺气不足者，多由脾气素虚，痰浊阻肺，痉咳日久，耗散正气，故证候以咳嗽无力、痰白清稀、神倦乏力、纳差食少、舌淡苔薄白为特征。 [其他疗法]1．中药成药2．单方验方3．推拿疗法4．针灸疗法 [其他疗法]1．中药成药（1）鹭鸶咳丸：每服１丸，１日2～3次。用于邪犯肺卫证、痰火阻肺证。（2）二冬膏：每服5～10g，１日２次。用于肺阴不足证。2．单方验方（1）胆汁疗法：新鲜鸡胆汁，加白糖适量，调成糊状，蒸熟服。每日每岁1/2只，最多不超过３只，分2次服，连服5～7日。用于痰火阻肺证。（2）大蒜疗法：紫皮大蒜，制成50％糖浆。５岁以内每次5～10ml，５岁以上每次10～20ml，每日3次，连服7日。用于痉咳期。 [其他疗法]3．推拿疗法逆运八卦，退六腑，推脾经，揉小横纹。１日１次，10次为１疗程。用于痉咳期。4．针灸疗法（1）刺四缝：常规消毒后点刺出粘液，左右手交替，治疗7～14日。用于痉咳期及恢复期。（2）针刺：主穴取合谷、尺泽、肺俞，配穴取曲池、丰隆、内关。泻法不留针。１日１次，5次为1疗程。用于痉咳期。 [预防与调护]1．预防（1）按时接种白百破三联疫苗。（2）易感儿在疾病流行期间避免去公共场所。（3）发现百日咳患儿要及时隔离4～7周。（4）与百日咳病儿有接触史的易感儿应观察３周，并服中药预防，如鱼腥草或鹅不食草，任选1种，15～20g，水煎，每日1剂，连服５天。 [预防与调护]2．调护（1）居室空气新鲜，但又要防止受凉，避免接触烟尘、异味辛辣刺激物。（2）注意休息，保证睡眠，保持心情愉快，防止精神刺激、情绪波动。（3）饮食富营养易消化，避免煎炸辛辣酸咸等刺激性食物。宜少食多餐，防止剧咳时呕吐。幼小患儿要注意防止呕吐物呛入气管，避免引起窒息。'