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'03-dna复制、修复与重组幻灯片 遗传物质的分子机制分子生物学的核心Watson&Crick:一种遗传物质，必须能行使两种功能，即自我复制和对细胞的高度特异性的影响遗传物质的基本属性：基因的自我复制控制性状的表达2004年秋分子生物学（HUST） DNA的生物学功能储存遗传信息复制遗传信息表达遗传信息产生可遗传的变异2004年秋分子生物学（HUST） 1.复制起点与方向（replicationorigin&direction）2004年秋分子生物学（HUST） richAT&palindromeEnzymesbindingsite300bp±inreplicationoriginofProkaryoteATrich复制起点的特征2004年秋分子生物学（HUST） “呼吸现象”DNA复制原点处氢键迅速断裂与再生，导致两条DNA链不断解链与聚合，形成瞬间的单泡状结构的过程。在富含AT的区域内尤为明显2004年秋分子生物学（HUST） 复制的多模式单起点、单方向多起点、单方向单起点、双方向多起点、双方向2004年秋分子生物学（HUST） 子链DNA延伸方向DNApolymerasereactsonthe3’endonly5’OHTCATCAC5’OH3’NewDNAelongationfrom5’to3’directionpppOHC++ppi2004年秋分子生物学（HUST） 如果DNA的延伸方向是3’→5’ATCG+5’pppOH3’GpppOHGATCG5’pppOH3’2004年秋分子生物学（HUST） ATCG+5’pppOH3’GpppOHG5’ppp因能量的需要，DNA的5’端必须带有PPP游离dNTP具有ppppppOH3’ATCG在0.2MNacl的生理环境中，磷酸基团间的强电负性，使dNTP难以聚合到DNA的5‘端，而且双链DNA的5’端碱基配对困难需要其他机制以解脱2004年秋分子生物学（HUST） 碱基发生错配后的校正……费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗ATCGpppOH+pppApOHTCGpppOHTCGTCGpppOH2004年秋分子生物学（HUST） 2.DNA的半保留复制（Semi-ConservationReplication）2004年秋分子生物学（HUST） 1958Meselson-stahl(CsClgradientcentrifuge)Sgenerations01.02.03.04.00+2.00+4.0N15N14DNASemi-ConservationReplication2004年秋分子生物学（HUST） 3.DNA半不连续复制（semi-discontinuousreplication）2004年秋分子生物学（HUST） 3‘5‘3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘2004年秋分子生物学（HUST） AtleastonestrandofDNAreplicationinOkazakifragment1kbDNAreplicationinOkazakifragment1kb5‘3‘5‘3‘（semi-discontinuousreplication!）Okazakifragment1968ReijiOkazaki2004年秋分子生物学（HUST） DNA复制的酶学DNA复制是一个非常复杂的酶学过程，它需要30种以上的酶和蛋白质，人们常把这些酶和蛋白质称为复制体系，其中一部分酶和蛋白质结合在一起，协同动作，构成所谓复制体（replisome）。2004年秋分子生物学（HUST） DNA聚合反应与聚合酶参与DNA聚合反应的有三种酶：PolI，PolII和PolIII，以四种核苷5’-三磷酸，即dATP、dGTP、dTTP和dCTP为前体合成聚核苷酸。PolII的具体作用还不清楚，根据实验室工作，它在复制过程中似乎没有什么作用，PolIII极其复杂，是大肠杆菌中是主要的聚合酶。2004年秋分子生物学（HUST） DNA聚合酶活性：在有引物和模板的情况下，PolI和PolIII都具有DNA聚合酶活性，但PolI的聚合酶活性主要用于DNA的修复和RNA引物的替换，而PolIII才是使DNA链延长的主要聚合酶。外切核酸酶活性：3’5’：校对、保真5’3’：PolIII只作用于单链缺口填充能力PolIII只能填充几个碱基的小缺口PolI可以填充很大的缺口2004年秋分子生物学（HUST） 其他酶类DNA连接酶螺旋酶DNA旋转酶………2004年秋分子生物学（HUST） DNA复制的基本过程2004年秋分子生物学（HUST） DNA复制的基本过程起始链延伸复制终止真正的酶促机理和新DNA分子合成的步骤是十分复杂的，需要多种特异性酶和蛋白因子的参与，涉及蛋白质、DNA和RNA等生物大分子之间的相互作用。2004年秋分子生物学（HUST） 1.DNA复制的起始DNA复制起始部位的序列特征DNA复制都是在特定起始部位(Ori)开始。大多数原核生物基因组和细菌质粒只有一个Ori位点，真核生物染色体中有多个Ori。由一个复制起始点构成的DNA复制单位称为复制子。原核生物染色体和质粒都是独立的复制子，真核细胞染色体中会有许多复制子。每个复制子在一个细胞周期中都必须起动而且只能起动一次。2004年秋分子生物学（HUST） 复制起点（origin）一般指的是DNA复制所必需的一段特殊的DNA序列。噬菌体、细菌染色体、质粒和一些动物病毒的DNA通常具有明显的复制起点。酵母也有特异的复制起点，在细胞周期S期染色体复制时起重要的作用。在真核生物中，复制起点很复杂，迄今仍难于在分子水平上阐明其特征。2004年秋分子生物学（HUST） E.coli、酵母和SV40的复制起始位点的一些共同特征复制起始位点中有多个独特的短重复序列。这些短重复序列被多亚基的复制起始位点结合蛋白识别，这些蛋白对于复制酶在复制起始位点的组装起关键作用。复制起始位点附近一般都有富含AT的序列，以利于DNA双链的解旋，产生DNA复制模板。2004年秋分子生物学（HUST） 复制起始位点共同的作用结合多种蛋白，并有助于它们之间的相互作用，从而有效地起始DNA的复制。复制起始位点可以决定基因组在S期复制的时间顺序。复制起始位点可以防止DNA复制干扰基因在S期的转录。2004年秋分子生物学（HUST） 参与复制起始的蛋白质SSBT抗原ORC、MCMp、Cdc452004年秋分子生物学（HUST） 引发DNA复制的起始就是引物的合成目前已知的DNA聚合酶都只能延长已存在的DNA链，而不能从头合成DNA链。研究发现，DNA复制时，往往先由RNA聚合酶在DNA模板上合成一段RNA引物，提供3’-OH，再由DNA聚合酶从RNA引物3’端开始合成新的DNA链。2004年秋分子生物学（HUST） 前导链的引发过程比较简单，只要有一段RNA引物，DNA聚合酶就能以此为起点一直合成下去。对于滞后链来说，引发过程就十分复杂，需要多种蛋白质和酶的协同作用，还牵涉到冈崎片段的形成和连接。2004年秋分子生物学（HUST） DNA复制的转录激活(transcriptionalactivation）RNApolymerase[RifS]10NtRNAprimerforleadingStrandorigindnaGprimase[RifR]forlaggingStrand2004年秋分子生物学（HUST） RNApolymerasePrimase(dnaG)(forprimerofLeadingStrand)(forprimerofLaggingStrand)RifSRifR合成的RNA分子与合成的非典型的mRNA分子与DNA模板分离DNA模板以氢键连接不分离可以使D.S.DNA解链为单链只能利用单链状态的DNA状态完成DNA复制的转录激活为模板合成<12Nt的RNA引物(也可利用dNt合成DNA引物)leadingstrand引物的合成是否primase单独存在时没有活性--由RNApolymerase完成转录只有与相关蛋白(dnaB.C)结合成激活合成的RNA分子作为引物复合体引发体（primosome)--或由primase(dnaG)接替在某种意义上讲,合成的引物primase译为引物酶？引发酶！仍无定论！更为确切！2004年秋分子生物学（HUST） primosomeSynthesisofprogenystrandinlaggingDNApppRNAasprimerDNApolymeraseIIIpppDNApolymeraseIDNApolymeraseIDNAligase2004年秋分子生物学（HUST） RNApol(RNApolymerase)[RifS]dnaG(primase)[RifR]完成对后随链引物的合成完成10±NtRNA引物合成后.DNApolII进行DNA链的延伸DNApolI对后随链的RNA引物切除并聚合填补连接酶(ligase）将Okazaki片段连接完成对先导链引物的合成实现DNA复制的转录激活起始较先导链的启动落后一个Okazaki片断Conclusion2004年秋分子生物学（HUST） 2.DNA链的延伸引发一旦完成，DNA聚合酶就在RNA引物的3’-OH端按照模板链的碱基顺序，以碱基互补的规则延伸DNA链。无论原核还是真核生物，前导链是按5’3’方向连续合成，后随链的延伸也是按5’3’，但不是连续合成，而是先合成多个RNA引物，再延伸为多个冈崎片段，最后连接起来。2004年秋分子生物学（HUST） 原核/真核生物DNA链延伸的不同主要是催化的酶不同E.coli前导链和后随链的合成都是由DNApolIII催化。SV40前导链和后随链的合成是由二个不同的DNA聚合酶催化完成的(DNApol向DNApol)2004年秋分子生物学（HUST） 3.DNA复制的终止一般说来，链的终止不需要特定的信号，也不需要特殊的蛋白质参与。但是，环状或线性DNA复制终止的机制却有所不同。2004年秋分子生物学（HUST） 环状DNA复制终止环状DNA复制时，可在离起始点180。相遇，即两个复制叉同时到达一个部位。有些环状DNA分子内含有终止位点，一个复制叉先到达该处停下来，然后另一个复制叉也到达该部位。如在正常情况下，λDNA复制时终止点与起始点相差180。。如果删去一些非必需区域，或者插入一些无关的片段从而改变了复制起始点和终止点的相对距离，经改造后的DNA复制终止点仍保持与起始点相差180。。表明λDNA分子没有特定的终止点。2004年秋分子生物学（HUST） 线状DNA的复制终止及避免5’末端短缩的模式（5’-endshortend）2004年秋分子生物学（HUST） 3’-OH?3‘-OHLaggingstrandofcircleDNAreplicationLaggingstrandoflinearDNAreplicationBut3‘5‘5‘3‘3’-OH?2004年秋分子生物学（HUST） T7phageDirectrepeatintheendoflinearDNAConcatermerbetweentwooffspringDNAafterreplication(100dNtterminalredundancy)2004年秋分子生物学（HUST） ??Concatermer（二联体）3‘-OHATCGTAGCATCGTAGC3‘-OH2004年秋分子生物学（HUST） ReplicationoflinearAdnovirus-2DNA35937bppTPCGIR103-162IR;including50bpreplicationoriginrichAT&1thC/GhighconservationpTP;pre-Terminalprotein80kd→TP55kdDBP;S.S.DNAbindingprotein72kdAd2DNApolymerase;140kd2004年秋分子生物学（HUST） 复制起始复合体引发复制（不需引物）避免5’-endshortentpTp-Ser-dCMPCG●过程SSB+ATPDNA末端解链TPpTP-Ser+dCTPpTP-Ser-dCMP3‘OH2004年秋分子生物学（HUST） IRIRCGGCGCCGpTP-Ser-dCMPReplacedS.SDNAHairpinPanhandlepTP-Ser-dCMPG3’G3’G3’TP2004年秋分子生物学（HUST） 真核生物染色体DNA末端补齐模式●端粒的发现1938MullerX-rayDrosophila末端极少发生缺失和倒位推测染色体两端存在特殊结构，使染色体趋于稳定.并定名为Telomer1938B.McClintock顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接。推测染色体末端具有特殊端粒结构。1970s分子生物学发展端粒研究获得突破2004年秋分子生物学（HUST） ●端粒DNA(Telomer)TTGGGG(T2G4)序列高度重复的末端5’TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGG3’(richGchain)3’AACCCCAACCCCAACCCC5’(richCchain)●1985.CarolGreider&Blackburn,1986.Gottchling尖毛虫telomerbindingprotein–155kdtelomerbindingprotein–226kd四膜虫telomerase将T2G4末端重复延伸游扑虫Telomerase=RNACAAAACCCC链+末端结合蛋白（TBP）+100bptelomer2004年秋分子生物学（HUST） ●modelTBPisReversetranscriptase-likeRNAcomplementwith3’endofDNA&astemplateforcDNAElongatedT2G43’-endasprimerfor5’-endDNAsynthesisG链–T2G4-----TTGGGGTTGGGC链--A2C4----telomerase3’aaaAACCCCAACuuac---5’TTG2004年秋分子生物学（HUST） telomerase3’CCAACCCCAACCCC---5’G链–T2G4-----TTGGGGTTGGGC链--A2C4----TTGtelomerase3’aaaAACCCCAACuuac---5’GGGTTGG链–T2G4-----TTGGGGTTGGGC链--A2C4----TTGGGGTTG-------------telomerase3’CCAACCCCAACCCC---5’telomerase3’CCAACCCCAACCCC---5’telomerase3’CCAACCCCAACCCC---5’WhenG-richstrandislongerenoughtelomerase3’aaaAACCCCAACuuac---5’2004年秋分子生物学（HUST） GGhoogsteenbondTetraplexhelixG链–T2G4-----TTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGTTGGGGC链--A2C4-----G链–T2G4-----TTGGGGttggggttgC链--A2C4-----AACCCCAAggggttgggPrimaseAACCCCAACCCCAACCCCAACCCCAACCCDNApolor2004年秋分子生物学（HUST） Telomeraseactivityisrepressedinsomaticcellsofmulticelluarorganismsresultinginagradualshorteningofthechromosomewitheachcellgeneration.AsthisshorteningreachesinformationalDNA,thecellssenesceanddie.细胞分裂端粒阈值2004年秋分子生物学（HUST） 细胞分裂次数与端粒长短呈正比细胞分裂端粒阈值端粒长短端粒酶活Harley(1989)端粒的重复片段为探针检测胎儿细胞株婴儿细胞株青年细胞株老年细胞株年龄小大端粒长度长短早老性侏儒症的端粒明显较正常人短“多莉”的衰老＞研究端粒（记时器）丢失的速率/年，预测人类的寿命XXXYwhy?PCD机制、癌细胞的无限繁殖2004年秋分子生物学（HUST） DNA复制的调控2004年秋分子生物学（HUST） λ噬菌体DNA的复制调控噬菌体和原噬菌体原噬菌体基因组整合在宿主染色体中，不能自主复制，依赖于宿主染色体进行复制，而且噬菌体基因表达被阻遏。2004年秋分子生物学（HUST） 几个概念λ噬菌体感染大肠杆菌以后。可将其基因组整合到细菌染色体上，并成为细菌基因组的—部分，随着染色体DNA的复制而复制。这种整合有噬菌体基因组的细菌称为溶原细菌，这一过程称为溶原途径。溶原性细菌—般不被同种噬菌体再行感染，这一现象称为免疫性。λ噬菌体感染宿主后也可以不通过溶原途径而利用细菌细胞内的成分进行繁殖，最终使宿主裂解而死亡，这一过程称为裂解循环，也称溶菌途径。溶原性细菌受某些外界物理或化学因素（如紫外线、丝裂霉素C等）的作用，原噬菌体可以脱离细菌染色体而进行自主复制，最终导致细菌裂解，游离出大量噬菌体，这一过程称为诱导。2004年秋分子生物学（HUST） λ噬菌体的生活史2004年秋分子生物学（HUST） 溶源性和裂解性的存活方式可以相互转化。2004年秋分子生物学（HUST） 2004年秋分子生物学（HUST） λ噬菌体的lysogenic和lytic两个生活史周期的发育过程是cI、cro、N、Q、cII/cIII等6个基因的控制下进行的。2004年秋分子生物学（HUST） 大肠杆菌DNA复制的调控高度保守的复制起点oriCA/T含量56％；碱基序列高度保守，某些部分种类不十分保守，但数目却是保守的；有9—14个GATC位点，GATC位点中腺嘌呤的甲基化对于oriC的功能不可缺少；有四个高度保守的DnaA识别位点；oriC中没有大于20个密码子的开放阅读框。2004年秋分子生物学（HUST） oriC质粒复制可分为6个阶段：转录活化及oriC－DnaA蛋白起始复合物的形成；DnaB、DnaC等蛋白相互作用形成前引物复合体；SSB与解旋酶参与复制，使双链DNA广泛解链并形成前引物合成复合物；由引发酶合成引物，完成复制起始；由DNA聚合酶III全酶在模板—引物复合物的引物3’末端延伸DNA链；由DNA聚合酶I、RnaseH和连接酶完成5’末端的修饰并连接为完整的DNA链，最后由促旋酶形成负超螺旋结构2004年秋分子生物学（HUST） ColE1质粒DNA复制调控2004年秋分子生物学（HUST） RepressormodelAntisenseRNAmodelRNA-2positivecontrol0-5550RNA-2RnaseHOHRNA-2DNA/RNAprimerforDNAreplicationNegativecontrol2004年秋分子生物学（HUST） RNA-1110bpRNaseH不能识别RNA-2,不能形成primer的3’-OH-555-4450RNA-2RNA-1RNA-2110bpD.S.RNA2004年秋分子生物学（HUST） RNA-10WhenRNA-2200-360NtRomgeneexpressionRNA-1/RNA-2D.S.repressionRNA-1/RNA-2不能形成primer的3’-OH促进限制63aaROP(Romprotein)RNA-2只能转录到100-220base,不能到达“0”原点不能形成primer的3’-OH02004年秋分子生物学（HUST） 真核细胞DNA的复制调控真核细胞的生活周期：G1：复制预备期S：复制期G2：有丝分裂准备期M：为有丝分裂期DNA复制只发生在S期2004年秋分子生物学（HUST） DNAreplicationatphaseSofcellcycleS6-8hsM1hG23-4hsmammaliancell22-25hrs500-5000bp/minG112hs2004年秋分子生物学（HUST） 真核细胞中DNA复制3个水平的调控：细胞生活周期水平染色体水平复制调控复制子水平调控2004年秋分子生物学（HUST） 第二节DNA修复（DNArepair）2004年秋分子生物学（HUST） DNA：遗传与变异遗传性和变异性的基础都是DNADNA损伤是某些因素作用下，DNA的结构和功能发生改变，阻碍DNA的复制与转录，DNA的这种变化称DNA的损伤，基因突变也是DNA损伤的一种。2004年秋分子生物学（HUST） 引起DNA损伤的因素：1、物理因素：紫外线：产生胸腺嘧啶二聚体电离辐射：引起DNA结构多种程度不同的损伤，这些损伤包括DNA的主链断裂，一条或二条链的断裂，碱基聚合，糖苷键的断裂等，引起大片段损伤或丢失，造成染色体畸变、基因突变、细胞死亡等。2、化学因素：烷化剂核苷酸类似物亚硝酸盐和亚硝胺代谢产生的活性物质3、生物因素：DNA病毒和RNA病毒感染、质粒转移、基因重组、转坐子的转位等都可能使DNA发生改变，引起基因突变。2004年秋分子生物学（HUST） 突变分类点突变DNA分子中单个碱基的改变，一种碱基被另一种碱基取代。同类碱基之间的取代，如A被G，或C被T取代，这类取代称转换。不同类碱基间的取代，如A被T，或C取代，T被A或G取代，这类取代称颠换。插入突变在DNA的某一位点插入一个或一个以上的碱基。丢失突变在DNA的某一位点缺失一个或一个以上的碱基。2004年秋分子生物学（HUST） 突变可能造成的后果(1)突变可能使生物更有利于适应环境，这种突变将会保留和遗传，引起生物的进化。(2)导致生物体的死亡或生命力的明显下降，属致死突变。(3)不致死，却引起形态和结构的异常，或发生营养缺陷，或出现新的有害特性。(4)引起细胞的癌变，癌基因和抑癌基因的突变是许多肿瘤发生的原因。(5)不发生任何变化和影响。2004年秋分子生物学（HUST） 基因突变的特征(1)突变以一定的机率随机发生;(2)突变有可逆性;(3)突变的发生率可被外界因素所加强;(4)突变是可以遗传的.2004年秋分子生物学（HUST） 修复绝大多数的损伤或突变在DNA未复制前就被修复，保持遗传的稳定性。生物体内存在多种修复机制，采用那一种修复机制对损伤的DNA进行修复，取决于DNA损伤的性质。2004年秋分子生物学（HUST） 复制过程中的错配修复机制(ξ=10-11)DNAmismatch+-----A------------C---DNApol(ξ=10-8)经第二次校正ξ=10-11MRSMismatchRepairSystem复制修复2004年秋分子生物学（HUST） 1.ungsystem(尿嘧啶-N-糖苷酶系统)---TAGC------ATCG------TAGC------ACG---U---TAGC---ung-aseGCUAU---TAGC------ACG---Apurinase(内切酶)---TAGC------ADNApolligaseTCG---2004年秋分子生物学（HUST） 2.MismatchrepairsystemDNApolymeraseligaseMCE(mismatchcorrectenzyme)3subunitsmutH,L,Sdamgenem6A甲基化酶Scanning新生链中错配碱基识别新生链中非m6A的GATC序列酶切含错配碱基的新生DNA区段2004年秋分子生物学（HUST） MCEscanningDNA中的GATC(palindromicseq.)为m6A甲基化敏感位点平均每2kb左右有一GATCseq.3’-------C----------CTAG----------CTAG----5’5’-----------T----------GATC----------GATC----3’3’-------------------------------------------------------5’少梯度多（m6A）新生链2004年秋分子生物学（HUST） MCEscanningendonucleasePolymeraseligaseGATCGATCCTAGCTAGTCGATCGATCCTAGCTAGTGATCGATCCTAGCTAGTA2004年秋分子生物学（HUST） phR471aaDNA的损伤修复1.photoreactivation----TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA--------TT--------AA----Beforereplication&Error-free400nmBluelight&phRgene(photo-reactivationenzyme)可见光激活2004年秋分子生物学（HUST） 2.Exision—RepairBeforeReplicationError-freeUvrA,B,CgeneEndonucleasesExonucleaseDNApolLigase切补修复2004年秋分子生物学（HUST） E.coli存活%U.V计量w.t.UvrA+RecA+RecA+uvra-reca-uvra-Rec-A.gene以某种方式参与DNA损伤修复3.Recombinative—Repair2004年秋分子生物学（HUST） Rupp.Howard-FlandersTTTTAAAATTTTTTTTAAAATTTT变性E.coli(Rec-A,uvr-6-)D.S.DNAS.S.DNAU.V.复制提取变性TTTTTTAAAAAAReplicationisforcedtoskippastTTdimergapleftinnewlystrand继续复制2004年秋分子生物学（HUST） ●存在与重组有关的暗修复机制●与Rec-A基因引起的strandtransfer有关●TTdimer未被修复，仅表现在后代群体中TTdimer浓度的稀释●链的非准确转移，导致突变机率的增加2004年秋分子生物学（HUST） Recombinative—Repair(strandtransferrepair)AfterreplicationrepairError-proneRecA,DNApolymeraeligasegenesbeneeded2004年秋分子生物学（HUST） 4.SOSrepairSOSrepairinE.colihavetobeinducedbyU.V.HighfrequencymutationbySOSrepair(Error-prone)2004年秋分子生物学（HUST） DNAdamaged300XsignalRecAcleavesLexASOSUmnCmutation---Beforeinducing.LexA-pRec-A,UmuC…11genesNeg.repression---U.V.damageDNASignal(S.S.DNAtailor5NtS.S.DNA)机制2004年秋分子生物学（HUST） RecA-P;三种功能●DNA重组活性●与S.S.DNA结合活性●少数蛋白的proteinase活性当DNA正常复制时（无复制受阻，无DNA损伤，无TTdimer）RecA-p不表现proteinase活性2004年秋分子生物学（HUST） 当DNA复制受阻/DNAdamaged能量大量消耗细胞内原少量表达的RecA-p与S.S,DNA结合激活RecA-p的proteinase活性修复损伤LexA-p降解RecA-p高效表达300timesupSOSopen2004年秋分子生物学（HUST） 当DNA复制度过难关后SOSrepair是一种error-prone极强的修复机制是进化中形成的“竭尽全力，治病救人”的措施（正常状态下，SOS是关闭的）RecA-p很快消失LexAgeneonSOSoff2004年秋分子生物学（HUST） 突变的形成DNA未经修复经过修复/校正死亡突变率降低倾向差错修复(重组修复，SOS）避免差错修复(光修复，切补修复)形成突变不形成突变DNAdamaged/mispairing物理诱变，化学诱变，自发突变突变是在修复过程中形成的（非准确的修复）2004年秋分子生物学（HUST） 第三节DNA重组2004年秋分子生物学（HUST） 自然界的DNA分子均是重组体变异是生物进化的重要因素之一生物对环境的适应机制自然选择的重要基础2004年秋分子生物学（HUST） 重组的本质基因的重排或交换，即2个DNA分子间或一个DNA分子的不同部位间，通过断裂和重接，交换DNA片段从而改变基因的组合和序列。遗传重组涉及到DNA分子内断裂-复合的基因交流过程，有时又叫做交换。2004年秋分子生物学（HUST） 遗传重组和重组DNA技术不是一回事！遗传重组指发生在生物体内的基因交流；重组DNA技术指在体外人为地将不同源的DNA组合在一起，是我们有目的有计划地改造生物体的一项技术和手段。2004年秋分子生物学（HUST） 重组分类：根据对DNA序列和所需蛋白质因子的要求，分为：同源重组（homologousrecombination）位点特异性重组（site-specificrecombination）转座作用（transposition）异常重组2004年秋分子生物学（HUST） 1.同源重组DNA同源序列间常发生于两个较长的同源DNA片段或同源染色体之间参与重组的两个DNA片断序列相同或者几乎相同如果是完全相同片断发生的交换称为对称交换，在遗传上是无意义的事件；如果发生交换的片断是序列相近的，这种交换我们称为不对称交换，由于它发生了染色体的变异，有基因的重复和缺失现象产生，是有遗传效益的重组事件。2004年秋分子生物学（HUST） 发生同源重组的条件：DNA分子接触；有缺口；RecA蛋白（重组酶）2004年秋分子生物学（HUST） 同源重组的基本特征涉及同源染色体的同源序列间的联会配对涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程单链DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号2004年秋分子生物学（HUST） 2.位点特异性重组两条双螺旋DNA特异位点不需要RecA，但需要相关酶高度保守性（保守重组）2004年秋分子生物学（HUST） attPofλpOp’attBofE.coliBOB’BOP’POB’Int(Integrase)IHF(Integrationhostfactor)Xis(Excisionase)FIS(factorofinversionstimulation)以λ噬菌体DNA整合为例2004年秋分子生物学（HUST） Specializedrecombinationinvolvesbreakageandreunionatspecificsites2004年秋分子生物学（HUST） 4Int-p3IHFXis-pPOP’-160-199-400+40+80P-----GCTTTTTTATACTAA----p’B-----GCTTTTTTATACTAA-----B’15bpofOsitehomologousSpecificintegrationsitesofINT-p,IHF,Xis-p2004年秋分子生物学（HUST） λ噬菌体DNA整合的分子机制2004年秋分子生物学（HUST） IntandIHFbindtodifferentsitesinattP.TheIntrecognitionsequencesinthecoreregionincludethesitesofcutting.2004年秋分子生物学（HUST） TheIntbindingsitesinthecorelieononefaceofDNA.ThelargecirclesindicatepositionsatwhichmethylationisinfluencedbyIntbinding;thelargearrowsindicatethesitesofcutting.PhotographkindlyprovidedbyA.Landy.2004年秋分子生物学（HUST） MultiplecopiesofIntproteinmayorganizeattPintoanintasome,whichinitiatessite-specificrecombinationbyrecognizingattBonfreeDNA.2004年秋分子生物学（HUST） 3.转座作用TransposonADNAsequenceabletoinsertitselfatanewlocationinthegenome(withoutanysequencerelationshipwiththetargetlocus).转座作用DNA的转座，或称移位，是由可移位因子介导的遗传物质重排现象。2004年秋分子生物学（HUST） “转座”？不十分准确，在转座过程中，可移位因子的一个拷贝常常留在原来的位置上，在新位点出现的是拷贝，因此，转座有别于同源重组，它依赖于DNA的复制。根据转座子复制与否，转座作用可分为:单纯转移复制转移2004年秋分子生物学（HUST） DNA转座现象的一般遗传特点a)不依赖Donorsite与Targetsite间序列的同源性(非同源重组过程，不依赖recA酶)b)转座插入的靶位点并非完全随机（插入专一型）c)某些转座因子（Tn3）对同类转座因子的插入具有排他性（免疫性）d)靶序列在转座因子两侧会形成正向重复(DR)e)转座因子的切除与转座将产生复杂的遗传学效应2004年秋分子生物学（HUST） 转座模型(a)转座酶结合转座子末端和新的目的位点；(b)在两条DNA链的特异位点切开，链交换后重新连接；(c)转座子从宿主DNA上完全切离；(d)目的位点复制成双份或；(e)每个转座子的链被拷贝；(f)产生共整合结构；(g)被解离酶分离。2004年秋分子生物学（HUST） 原核生物的转座因子的种类：ISCompositetransposonTnAfamilyTransposablephage复制型转座子(replicatingtransposableelement)2004年秋分子生物学（HUST） a.插入序列（insertionsequenceIS）●GATCGTC--------------------------GACGATCl7002000basepair（bp）IRIRGATCGTC--------------------------GACGATCCTAGCAG---------------------------CTGCTAGStem-loop5’GATCGTC3’CTAGCAG2004年秋分子生物学（HUST） lIS插入targetsite后targetsequencerepeatsdirectlyflankedtheIS2004年秋分子生物学（HUST） b.复合因子（compositeelement/compositetansposon）lTn1(AmpR)Tn2(AmpR)Tn3(AmpR)Tn4(AmpRStrR)Tn5(KanR)Tn6(kanR)Tn7(StrRTmpR)Tn9(CamR)Tn10(TetR)2004年秋分子生物学（HUST） ●IS插入到功能基因两端，可能形成复合转座因子ISISISISLISR臂中心区臂transpositionmutation2004年秋分子生物学（HUST） ●复合转座子一旦形成，转座功能受较多因子调控●结构特点IRIRIRIRIRIRIS10LTn10(9.3kb)IS10RIRIRIRIRDRDRIS1LTn9(2.5kb)IS1R2004年秋分子生物学（HUST） ●稳定性ExciseorDeletionDR型(Instable)2004年秋分子生物学（HUST） IR型(Stable)InversionBAABBA2004年秋分子生物学（HUST） donorStaggeredcutreceptor转座机制replicatingtranspositioninprokaryoteTntargetStrandstransfer2004年秋分子生物学（HUST） copyingofTn&targetTnDRTnDRDonorreceptorcointegrater&resolution2004年秋分子生物学（HUST） Conclusiona)转座过程是由Donor提供Tncopy到targetsite，涉及酶切、复制、重组的遗传过程b)转座完成后，在Tn两侧出现targetsite序列的正向重复其长度取决于staggeredcutting的长度c)转座因子的IR序列是转座酶的重要识别位点，与转座，切除有关d)Cointegrater是转座过程的中间体(具有两个Tn和两个replicon),其稳定性依Tn不同而异，或resolution完成转座过程，或共联导致Tn和抗性的积累。2004年秋分子生物学（HUST） 3.3.2真核生物的转座因子及转座机制2004年秋分子生物学（HUST） 转座：DNA－－DNA返座：DNA－－RNA－－DNA类似反转录病毒真核生物的转座因子的种类2004年秋分子生物学（HUST） I型；转座II型；返座果蝇：Copia酵母：Ty1Alufamily果蝇：P、FB玉米：Ac/Ds,Spm/dspm,DtIR,transposase,needed2004年秋分子生物学（HUST） 单纯转移和复制转移机制2004年秋分子生物学（HUST） BothstrandsofTn10arecleavedsequentially,andthenthetransposonisjoinedtothenickedtargetsite.Nonreplicativetranspositionproceedsbybreakageandreunion2004年秋分子生物学（HUST） Nonreplicativetranspositionresultswhenacrossoverstructureisreleasedbynicking.ThisinsertsthetransposonintothetargetDNA,flankedbythedirectrepeatsofthetarget,andthedonorisleftwithadouble-strandbreak.Nonreplicativetranspositionproceedsbybreakageandreunion2004年秋分子生物学（HUST） Mutranspositiongeneratesacrossoverstructure,whichisconvertedbyreplicationintoacointegrate.Replicativetranspositionproceedsthroughacointegrate2004年秋分子生物学（HUST） Transpositionmayfuseadonorandrecipientrepliconintoacointegrate.Resolutionreleasestworeplicons,eachcontainingacopyofthetransposon.Replicativetranspositionproceedsthroughacointegrate2004年秋分子生物学（HUST） 转座作用的遗传效应转座引起插入突变转座产生新的基因转座引发DNA重排（DNA缺失或者倒位）转座引起的生物进化2004年秋分子生物学（HUST） Reciprocalrecombinationbetweendirectrepeatsexcisesthematerialbetweenthem;eachproductofrecombinationhasonecopyofthedirectrepeat.TransposonscauserearrangementofDNA2004年秋分子生物学（HUST） Reciprocalrecombinationbetweeninvertedrepeatsinvertstheregionbetweenthem.TransposonscauserearrangementofDNA2004年秋分子生物学（HUST） 转座子的调控机制以Tn10为例复合转座子，转座活性受许多因子调控。转座酶浓度很低，极少引起转座。细胞自发转座的比率只有10－7。如果由含Tn10转座酶基因的工程质粒来提供更多的转座酶的话，Tn10的转座频率可以提高1000倍以上。2004年秋分子生物学（HUST） TwopromotersinoppositeorientationlieneartheoutsideboundaryofIS10R.ThestrongpromoterPOUTsponsorstranscriptiontowardtheflankinghostDNA.TheweakerpromoterPINcausestranscriptionofanRNAthatextendsthelengthofIS10Randistranslatedintothetransposase.Tn102004年秋分子生物学（HUST） SeveralmechanismsrestrainthefrequencyofTn10transposition,byaffectingeitherthesynthesisorfunctionoftransposaseprotein.Transpositionofanindividualtransposonisrestrictedbymethylationtooccuronlyafterreplication.Inmulticopysituations,cis-preferencerestrictsthechoiceoftarget,andOUT/INRNApairinginhibitssynthesisoftransposase.Tn102004年秋分子生物学（HUST） 第3章结束Thanks！ 《陈情表》阅读理解 1．对下列句中加线词语的解释有误的一项是A．臣以险衅，夙遭闵凶险衅：指命运不好。B．生孩六月，慈父见背见背：离开我，这里指死去。C．臣欲奉诏奔驰奔驰：驾车快跑。D．臣之辛苦辛苦：指辛酸苦楚的处境。【解析】C项，奔驰：赶快前往，这里指赴京就职。【答案】C 2．句中加线虚词的意义与用法相同的一项是A.生孩六月，慈父见背信而见疑，忠而被谤B.州司临门，急于星火请奉命求救于孙将军C.臣以供养无主，辞不赴命扶苏以数谏故，上使外将兵D.臣欲奉诏奔驰，则刘病日笃有则改之，无则加勉。【解析】A项，用在动词前，表示对自己怎么样/用在及物动词之前表被动；B项，介词，表比较，比/介词，引出动作行为有关的对象；C项，都是介词，因为；D项，连词，表转折，可是/连词，就。【答案】C 3．下列各句中没有通假字的一项是()A．零丁孤苦，至于成立B．逮奉圣朝，沐浴清化C．而刘夙婴疾病，常在床蓐D．臣以险衅，夙遭闵凶【解析】A项，零丁，通“伶仃”，孤单的样子；C项，蓐，通“褥”，垫子；D项，闵，通“悯”，可忧患的事。【答案】B 4.句中加线词语的用法与例句相同的一项是例句：非臣陨首所能上报A．历职郎署B．则刘病日笃C．臣具以表闻D．是以区区不能废远【解析】　例句为名词作状语，向上。【答案】BA项，名词活用作动词，任职。B项，名词作状语，一天比一天。C项，动词的使动用法，使……闻。D项，形容词活用作动词，远离。 5．各句的句式和其他三项不相同的一项是A．州司临门，急于星火B．是臣尽节于陛下之日长C．今臣亡国贱俘，至微至陋D．人固有一死，或重于泰山，或轻于鸿毛【解析】C项是判断句式，其他三项均为状语后置句。 6、下列加点字注音正确的一组是（）A.险衅（xìn）　　　　祚薄（zuò）床蓐（rù）　　　　茕茕孑立（qióng）B.洗马（xǐ）逋慢（bū）拔擢（zhuó）终鲜兄弟（xiǎn）C.优渥（wò）期功（qī）闵凶（mǐn）逮奉圣朝（dài）D.伪朝（wèi）矜悯（jīn）郎署（shǔ）猥以微贱（wèi）【答案】A 7、下列各组词语在文中的意思解释错误的一项是(  )A.举臣秀才：举，举荐。秀才，科举院试考中后称秀才。B.供养无主：供养祖母的事无人操持。C.拜：授官或封爵。D.除：任官，除去旧官任命新官。洗(ｘｉǎｎ鲜)马：也称“先马”，汉时为太子的属官，晋以后改掌图籍。【答案】A 8、下面句子中都是反映李密家境状况的一组是①外无期功强近之亲，内无应门五尺僮②茕茕孑立，形影相吊③行年四岁，舅夺母志④但以刘日薄西山，气息奄奄，人命危浅，朝不虑夕⑤是以区区不能废远⑥母孙二人，更相为命A、①②③⑤      B、②③④⑤      C、①②④⑥   D、①②④⑤【答案】C 9、比较下列两组句子中加点字的意义和用法，判断正确的一项是（　　）①是以臣尽节于陛下之日长②臣之进退，实为狼狈③臣以供养无主，辞不赴命④伏惟圣朝以孝治天下A.①②相同，③④不同。B.①②相同，③④也相同。C.①②不同，③④相同。D.①②不同，③④也不同。【答案】D 10、下列句子中与其他三句句式不同的一项是（）A.既无伯叔，终鲜兄弟B.前太守臣逵察臣孝廉，后刺史臣荣举臣秀才C.臣密今年四十有四，祖母今年九十有六D.臣之辛苦，非独蜀之人士及二州牧伯所见明知【答案】D 12、下列加点的成语使用不恰当的一项是（　　）A.一个远涉重洋、寄身美国、茕茕孑立的中国弱女子，要控告有钱有势的美国地头蛇是何等艰难!B.在已经气息奄奄的暮年，他坐在公园的石凳上沉思往事，突然发现自己所崇拜的偶像不过是个华而不实、自私自利的小人。C.当一名人质实在是太累了，太紧张了，太朝不虑夕了。D.孤苦伶仃的石家母子，冒着生命危险，把这把七星刀一直保存到解放。【答案】B 13、下面关于“表”这种文体的说明不正确的一项是A.“表”是纪传体史书中的一种体裁，如同现代史书的大事纪年表，比如《史记》就有“十表”。B.“表”是臣下向皇上言事的一种文体，表有分条陈述之意C.“表”是古代奏章的一种，多用于臣向君表白心迹，陈请谢贺。D.“表”还有一种作用，就是向敌对一方发的宣战书，称作“战表”。【答案】B 14、各组词语在文中的意思解释错误的一项是A.门衰：家门衰微。祚(ｚｕò作)薄：福薄B.外无期(ｊī机)、功强近之亲：功，指穿大功服九个月、小功服五个月的人。这些都是同族关系较近的人。C.茕茕孑立：无依无靠，孤孤单单。茕：孤单无援的样子。孑立：孤立无依。D.形影相吊：吊：悼念。【答案】D 15、“是以区区不能废远”“未曾废离”；“犹蒙矜育”“不矜名节”与上述两组句子中，加点词词义相同的一项是(  )A.两个“废”字相同，两个“矜”字不同。B.两个“废”字相同，两个“矜”字也相C.两个“废”字不同，两个“矜”字相同D.两个“废”字不同，两个“矜”字也不同【答案】A 16、指出各句词解释有误的一项是（）A、逮奉圣朝，沐浴清化。逮：及，至B、凡在故老，犹蒙矜育。矜：怜惜C、臣欲奉诏奔驰，则刘病日笃。笃：更加D、但以刘日薄西山，气息奄奄。薄：迫近【答案】C 17、下列句子中加点词的意义与现代汉语不同的一项是（）A、祖母刘悯臣孤弱，躬亲抚养B、零丁孤苦，至于成立C、茕茕孑立，形影相吊。D、臣之进退，实为狼狈【答案】B 18、分析比较下列句中“以”的意义用法，判断正确的一项是（）①臣以供养无主，辞不赴命。②但以刘日薄西山，气息奄奄。③臣具以表闻，辞不就职。④臣不胜犬马怖惧之情，谨拜表以闻。A、①和②相同③和④不同B、①和②不同③和④相同C、①和④相同②和③不同D、①②③④各不相同A 19、指出表述有误的一项（）A、晋武帝征诏李密为太子洗马，李密不愿应诏，就写了这篇申诉自己不能应诏的苦衷的表文。B、本文开篇就提出不愿应诏，接着从自己幼年的不幸遭遇写起，说明自己与祖母相依为命的特殊感情，致使君王收回成命。C、本文叙述委婉，辞意恳切，语言简洁生动，富有表现力与强烈的感染力。D、文章始终围绕“愿乞终养，辞不赴命”展开，在简洁的笔墨中寄寓了深深的情感。B 20、、课文名句填空。(1)、外无期功强近之亲，，，形影相吊。(2)、臣欲奉诏奔驰，；，。(3)、臣无祖母，；祖母无臣，。(4)、但以刘日薄西山，，人命危浅，。（5）、臣生当陨首，。 A.逮奉圣朝，沐浴清化。B.前太守臣逵察臣孝廉，后刺史臣荣举臣秀才，臣以供养无主，辞不赴命。译：到了侍奉圣朝之时，我受到清明的政治教化的熏陶。译：先是太守逵察举我为孝廉，后来刺史荣举荐我为秀才，我因祖母无人供养，都表示辞谢，没有前往赴命。 C.诏书特下，拜臣郎中，寻蒙国恩，除臣洗马。D.猥以微贱，当侍东宫，非臣陨首所能上报。译：陛下特地下达诏书，任命我为郎中，不久又蒙朝廷的恩宠，不让我再给太子洗马。译：凭我这样的微贱之人，担当侍奉太子的官职，我即使肝脑涂地，也无法报答皇上的恩宠。 1、对下列句子中加线词语的解释，不正确的一项是()A．过蒙拔擢，宠命优渥宠：恩荣。B．但以刘日薄西山，气息奄奄薄：迫近。C．母孙二人，更相为命更：交互、交替。D．愿陛下矜悯愚诚，听臣微志听：听信。【解析】　听：任，这里指准许、成全。【答案】D 2、下列各句中，“以”字的意义和用法与例句相同的一项是()例：是以区区不能废远A．谨拜表以闻B．臣以险衅，夙遭闵凶C．猥以微贱，当侍东宫D．伏惟圣朝以孝治天下【解析】　例句和B项都作“因为”讲；A项，连词，表目的，是固定结构，用来……的办法；C项，介词，“凭”；D项，介词，“用”。【答案】B 3、下列对原文有关内容的概括和分析，不正确的一项是A．这两段重在叙事中动以深情，在陈情中晓以大义。B．在陈情中既表达自己“愿乞终养”的决心，又表达了活着尽忠效力，死后亦当感恩图报的感情。C．“但以刘日薄西山，气息奄奄，人命危浅，朝不虑夕”以落日喻人命，贴切地刻画了祖母苍老多病的形象，融入浓烈的感情色彩，极大地引发读者的同情。D．作者用两个年龄数字作对比，意在表明尽孝比尽忠重要。【解析】　作者用两个年龄数字作对比，目的在于表明“先尽孝后尽忠”。【答案】D 4、把文中画横线的句子翻译成现代汉语。(1)母、孙二人，更相为命，是以区区不能废远。(2)、臣不胜犬马怖惧之情，谨拜表以闻。(1)、我们祖孙二人，相依为命，就因为这一点私情，我不能废止奉养祖母而远离。(2)、我实在承受不住犬马(在主人面前)惶惑恐惧的心绪，恭敬地呈上此表来使陛下知道这件事。 5、对下列句子中加线字的解释，有误的一项是（）A.除臣冼马除：革除B.以刘日薄西山薄：迫近C.则刘病日笃笃：病重D.逮奉圣朝，沐浴清化逮：到了A除：授予官职。 6、下列句中，加点文言虚词的意义和用法完全相同的一项是（）A．①州司临门，急于星火②是臣尽节于陛下之日长B．①臣之进退，实为狼狈②况臣孤苦，特为尤甚C．①但以刘日薄西山②猥以微贱，当侍东宫D．①报养刘之日短也②奚以之九万里而南为A项，①介词，比；②介词，对、向；B项，①②都为动词，是；【答案】BC项，①连词，因为；②介词，凭……的身份；D①结构助词，的；②动词，去、往、到。 7、下列语句中加点的词语，活用类型不相同的一组是（）A.①且臣少仕伪朝，历职郎署②虽然，犹有未树也B.①非臣陨首所能上报②雄州雾列，俊采星驰C.①臣具以表闻②屈贾谊于长沙D.①是以区区不能废远②宾主尽东南之美A项，①②均为名词活用为动词；B项，①②均为名词活用作状语；C项，①②均为动词的使动用法；D项，①形容词活用为动词，远离、离开；②形容词活用为名词，才俊。 12．对下列句子中加线词的解释，不正确的一项是()A．况臣孤苦，特为尤甚（更严重）B．过蒙拔擢，宠命优渥（提拔，提升）C．皇天后土，实所共鉴（共同审察）D．庶刘侥幸，卒保余年（差不多）D(庶：或许) 13．下列句子与“是以区区不能废远”句式相同的一项是（）A．州司临门，急于星火B．沛公安在C．是臣尽节于陛下之日长，报养刘之日短也D．臣以供养无主【答案】B（宾语前置。） 14．下列对文章的分析，不正确的一项是（）A．李密在这之前很少做官，显示了他无意以名誉节操来炫耀。B．文字融入了作者强烈的感情，在述说自己和祖母相依为命的深厚亲情时，是通过叙事来表达的。C．对仗工整的对偶句式，铿锵有力，感情热切，具有说服力；运用“乌鸟私情”“结草”等故事来增加文章的感染力和说服力。D．作者在文字中多写孝道，但并没有把孝情一泻到底，而是用理性对感情加以节制，使它在不同的层次中，不同的前提下出现。【答案】A（错在“李密在这之前很少做官”，应是他年轻时就任蜀汉官职。）'