最新微生物学实验二--培养基配制、相关器皿的包扎及课件PPT.ppt 96页

'微生物学实验二--培养基配制、相关器皿的包扎及 本次实验的目的和要求明确培养基制备原理通过对培养基的配制，掌握配制培养基的一般方法和步骤了解消毒、灭菌的原理及方法，掌握干热灭菌和高压蒸汽灭菌学习并练习相关器皿的包扎方法 内容一培养基及无菌水的制备 4、培养基的分类（1）按成分分——对成分种类、量是否清楚天然培养基合成培养基（组合培养基）半合成培养基（也称半组合培养基）（2）按物理状态分固体培养基（凝固剂的使用1.5%-2.5%)；固体基质的使用）半固体培养基（凝固剂使用量较低0.2-0.7%）液体培养基（工业生产中的重要性）脱水培养基（也称预制干燥培养基） （3）按培养基对微生物的功能分基础培养基：含有一般微生物生长繁殖需要的基本营养物质。选择性培养基：根据某种微生物的特殊营养要求或其对某化学、物理因素的抗性而设计的培养基，具有使混合菌样中的劣势菌变成优势菌的功能，广泛用于菌种筛选等领域。“投其所好、取其所抗”。——高通量筛选的建立。鉴别性培养基：在培养基中加入有能与目的菌的无色代产物发生显色反应的指示剂，从而达到只须用肉眼辨别颜色就能方便地从近似菌落中找出目的菌菌落的培养基。——直观、专一性（伊红美兰培养基，EMB） 大肠杆菌在EMB培养基上的形态 二、培养基的配方一个实验班共配置3种固体培养基：牛肉膏蛋白胨培养基高氏1号培养基马丁氏培养基按照老师的划分进行，每个实验小组都要准备，几个实验小组配1种培养基，供全班使用 1、牛肉膏蛋白胨培养基（分离、培养细菌用）——500ml/组牛肉膏3.0g蛋白胨10.0gNaCl5.0g水1000ml琼脂15～20gpH7.4～7.6 可溶性淀粉20gNaCl0.5gKNO31.0gK2HPO4·3H2O　　0.5gMgSO4·7H2O0.5gFeSO4·7H2O0.01g琼脂15～25g水1000mlpH7.4～7.6临用时无菌操作在800ml培养基中加入3%的K2Cr2O7溶液1ml2、高氏1号培养基（分离、培养放线菌用）——500ml/组 KH2PO41gMgSO4·7H2O0.5g蛋白胨5g葡萄糖10g琼脂20g水1000mlpH6.0配好后在此培养基中，按1000ml加入1%孟加拉红水溶液3.3ml。临用时以无菌操作在100ml培养基中加入1%的链霉素0.3ml，使其终浓度为30ug/ml。3、马丁氏培养基（分离、培养真菌用）——500ml/组 三、培养基配制的步骤1、计算按照配方要求（一般为1000ml的量）和实际配制培养基的量，计算出不同组分需要的量。 2、称量、溶解按培养基配方在三角瓶中先加水（如无加入后大幅度改变原体积的物质，可以把水加足），然后依次准确称取各药品并分别逐一溶解于其中（琼脂需加热溶解），最后补充水到所需体积。（注意：各成分之间发生化学反应产生不溶的沉淀；培养基成分中有影响pH试纸的显色的物质，调pH值后再加入） 3、调pH用5~10%NaOH、1~5%HCl溶液将培养基的pH调到所需范围，根据需要用精密pH试纸或pH计来确定。4、包扎（有一定规范要求）5、灭菌（高压蒸汽灭菌：121.3℃,15～30min） 四、培养基配制过程中需注意的事项先加水——易产生沉淀逐一溶解——易产生沉淀调节pH——容易忘记加塞灭菌（或过滤除菌）——即时灭菌煮过或加热过培养基，注意水的蒸发——补足 五、培养基配制中的2点说明1、量微的药品（天平无法称量），以溶液形式加入（先配制成一定浓度的溶液）；2、粘稠的药品和物品，称好后与称量纸一起放入溶液中，待药品溶解后取出称量纸；或利用减称量法完成（从总药品量中以减量称出所需要的量）。 六、无菌水的准备经灭菌处理后的蒸馏水或自来水。1、量取90mL蒸馏水在250mL三角瓶，内加玻珠1瓶2、吸取9mL蒸馏水在18*180试管中6支包扎后灭菌。 注意！！标记（记号笔）写在器皿壁或外包装纸上（如还需要高压蒸汽灭菌，只能写在外包装纸上）；不要直接写在瓶（管）塞或包装棉布上。 内容二消毒与灭菌 一、消毒、灭菌的定义和常见方法消毒：指消灭病原菌和有害微生物的营养体。灭菌：指杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。常见方法：加热法：包括干热灭菌和湿热灭菌过滤除菌辐射灭菌化学药品灭菌 高温灭菌或消毒的方法 过滤除菌技术（正压和负压之分）滤膜过滤器——微孔滤膜（醋酸纤维、硝酸纤维、火棉胶、有机大分子物质），孔径0.22和0.45um。玻璃滤器——玻璃粉烧结板（G1~G6）蔡氏（Seitz）滤器——多层石棉纤维板（整体为金属制成）其它（不常见）——陶瓷、硅藻土制滤烛形：——张伯伦（Chamberland）滤器——伯克菲尔德（Berkefeld）滤器——曼德勒尔（Mandler）滤器 膜过滤装置 不耐热的液体培养基的除（灭）菌 膜过滤装置 细菌截留于膜过滤器滤膜表面 二、加热灭菌的方法1、干热灭菌法：火焰灼烧法烘箱内热空气灭菌法2、湿热灭菌（消毒）法：常压下：巴氏消毒法；煮沸消毒法；间歇灭菌法。加压下：常规加压灭法；连续加压灭菌法。 三、干热灭菌火焰灼烧灭菌和热空气灭菌两种方法。通常所说的干热灭菌是在电热干燥箱内利用高温干燥空气（160~170℃）进行灭菌，此法适用于玻璃器皿（吸管、培养皿等）的灭菌。 干热灭菌需要注意的事项不能对塑料器皿和培养基灭菌；控制好温度和时间（160~180℃，2小时），防止包扎的报纸焦糊；灭菌过程（未完全冷下来，60℃以下）不要打开烘箱门，防止报纸着火或玻璃器皿遇冷爆裂。 四、高压蒸汽灭菌锅的结构及使用 高压蒸汽灭菌的原理高压蒸汽灭菌器是利用加压的饱和蒸汽（潜热）对物品、器械、药液等灭菌的设备，适用于科学研究、医疗卫生、食品等实验室或工厂使用——造成蛋白质等变性失活。潜热是指当1g100℃的水蒸汽变成1g100℃水时，释放出2255.2J（1卡=4.184焦耳）的热量。各种高压蒸汽灭菌器之间的区别只在于自动化程度的高低（水位控制、温度恒定控制、时间控制、自动排放冷空气、程序化显示）饱和蒸汽压压力指示温度直接利用温度探测器指示温度 典型的高压蒸汽灭菌锅纵剖面结构压力调节器安全阀排气口控制柄记录仪门垫圈放电器蒸汽阀蒸汽夹层阻板蒸汽供给蒸汽供应阀温度感应器蒸汽凝汽瓣废汽冷凝器蒸汽通入夹层蒸汽由夹层到灭菌室夹层冷凝水收集口蒸汽由夹层进入灭菌室和蒸汽排出口 卧式灭菌锅示意图（简图）蒸汽进口灭菌过程出气口（冷空气和蒸汽）灭菌时间到排汽口压力表蒸汽排气阀温度计阀蒸汽供应阀门消毒室夹套（层） 立式压力灭菌器 手提式灭菌锅 卧式矩型和圆型压力蒸汽消毒器 高压蒸汽灭菌过程：1、取出内筒，检查水位；2、加水至淹过电发热管和内筒支架；3、放入内筒，并在其中放入需灭菌物品（要求松散）；4、加盖（对称旋紧），打开放汽阀；5、加热（有内外两种），升温；6、排除冷空气——由放汽阀冒汽3~5分钟；7、关闭放汽阀（有些灭菌锅灭菌过程中一直保持较小排气或到一定温度自动关闭），加压升温至所需温度或压力；8、保温定时至所需时间；9、不再加热，降温至压力表为“0”，打开放汽阀；10、开盖取物（注意蒸汽烫伤）。 空气排除度对灭菌温度的影响压力表读数锅内温度（℃）kg/cm2磅/吋2MPa饱和蒸汽排除1/2空气不排除空气0.3550.031108.894720.70110.076115.6110901.05150.108121.31121001.40200.142126.21181091.75250.172130.01241152.10300.213134.6128121 一些细菌芽孢湿热灭菌所需时间 消毒、灭菌的生物指示菌嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillusstearothermophilus）结核分枝杆菌——致病菌指示菌（Mycobacteriumtuberculosis沙门氏菌——致病菌指示菌（通用检测）（Salmonellaspp） 高压蒸汽灭菌效果的监测方法（3种）1、工艺（程序）监测——压力表、温度计等，最常见，每次都使用；2、化学指示监测——特定化合物熔点（熔化前后晶体形态不同，硫磺熔点115℃、乙酰替苯胺116℃、脱水琥珀酸120℃、苯甲酸122.4℃等结晶）、灭菌指示胶带（变色反应）；3、生物指示剂监测——特定微生物（需经培养）。 五、实验室常用灭菌方法1、高压蒸汽灭菌——常用121.3℃，20min和115℃，10min两种条件进行；适用于耐热性溶液、培养基和水的灭菌；2、热空气干热灭菌——160~170℃，2hr；适用于玻璃器皿和金属工具的灭菌；3、灼烧灭菌——酒精灯和电加热，适用于接种工具的灭菌；4、过滤除菌——现在一般使用微孔滤膜（0.22μm或0.45μm），适用于非耐热性溶液和培养基的过滤除菌。 内容三相关器皿的包扎方法 一、器皿包扎的作用1、湿热灭菌时防止冷凝水的污染；2、灭菌后可以长期放置，保持器皿等的无菌状态和防止灰尘的污染。 二、相关器皿的包扎要求利用报纸、牛皮纸或专用器械包扎，重点练习报纸包扎。1、培养皿的包扎——双层大报纸、12套包扎成1包2、吸管的的包扎——吸管先塞棉花（松紧适度），利用宽5cm左右的长条形报纸裹扎3、试管和三角瓶的包扎4、涂布器（刮子）的包扎 三、包扎中的几点说明包扎纸大小适中，器皿或器材不外露，塞子、纱（棉）布、瓶口、管口等不外露。包扎试管和三角瓶时，包扎线向下一点，不要扎在塞子上。装有培养基等液体的容器，包扎过程或包扎好后不要倒置（包括水平放置），以免造成污染（塞子）和内装液体不准。 四、利用吸管筒（铜制或不锈钢制）包扎吸管灭菌 不锈钢吸管筒、培养皿筒 本次实验完成的内容1、90mL无菌水1瓶（250mL三角瓶，内加玻璃珠）2、9mL无菌水6支（18×180试管）3、1mL无菌吸管6支4、培养基１瓶（500mL，三种之一）5、9cm培养皿1包（12个）6、涂布刮子4支 思考题1、在配制培养基的操作过程中应该注意些什么问题？为什么？2、高压蒸汽灭菌之前，为什么要将锅内冷空气排净？灭菌完毕后，为什么要待压力降至“0”时才能打开排气阀，开盖取物？ 下周的实验内容实验三微生物的分离和纯化要点：无菌操作技术的概念、重要性及实现方式微生物的分离和纯化的原理和方法 术前肺功能测定及其临床意义复旦大学附属中山医院呼吸病研究所蔡映云 术前肺功能测定的意义估计手术的风险制订术前准备术后并发症预测和预防手术方案的设计和修改术后处理和监测的预案术后肺功能和活动能力的预计 常见的PPCs感染：肺炎、支气管炎肺不张支气管痉挛心原性或非心原性肺水肿肺栓塞长时间留置气管导管呼吸衰竭 一.PPCs的病理生理机制肺容量减少气体交换障碍呼吸中枢驱动削弱膈肌功能受损肺防御机制削弱 引起PPCs的因素患者因素手术因素麻醉因素 1.患者因素老龄　换气功能肥胖动脉血气营养不良病变分布吸烟史伴发症：心功能、贫血通气功能 2.手术因素手术类型（急诊、择期）手术部位手术范围手术方法手术时间输血量 3.麻醉因素（1）椎管内麻醉和全身麻醉不如局部麻醉和神经阻滞安全。（2）椎管内麻醉中硬膜外麻醉比脊麻可控性强，更安全。（3）全身麻醉可抑制呼吸中枢，减少肺活量致小气道陷闭，引起V/Q失调，抑制粘膜上皮细胞纤毛功能。（4）合并使用阿片类、镇静剂、肌松剂可抑制呼吸中枢或神经肌肉功能。 可以增加PPCs的因素手术部位胸腔或靠近膈肌手术时机急诊手术或限期手术手术时间>3小时病员一般情况年龄、肥胖、营养心脏情况近期内心梗、慢性心衰和肺心病肺部情况有阻塞性或限制性肺病吸烟史戒烟时间<8周 二.肺功能评估方法病史现病史既往史、个人史：伴发症、住院、手术、用药情况、麻醉史、围术期情况、吸烟史体检可发现异常体征胸部平片呼吸功能检查 肺功能测定的项目肺容量通气功能换气功能动脉血气心肺运动试验 术前肺功能检查的适应证年龄>65岁肥胖病人胸部手术上腹部手术吸烟史心肺疾病史 肺容量 FourCapacitiesFourvolumes肺总量TLC潮气量TV肺活量VC补吸气量IRV深吸气量IC补呼气量ERV功能残气量FRC残气量RV 2.通气功能用力肺活量测定 利用肺量计可以测定的肺通气指标用力肺活量（FVC）第一秒用力呼气量（FEV1）一秒率（FEV1/FVC%）最大呼气中期流速（MMEF）分钟最大通气量（MVV）上述参数通常以占预计值的百分数表示预计值则以年龄、性别、身高、体重校正后得出 用力肺活量（FVC）及第一秒用力呼气量（FEV1）对开胸手术及肺叶切除术的预测价值最大比较使用支气管舒张剂前后的FVC及FEV1，能有效地反映肺功能可逆程度 分钟最大通气量（MVV）是阻塞性、限制性通气功能障碍、肌力、营养状况等因素的综合反映 术前FEV1>2L安全1-2L有一定风险<0.8L风险极大缺点：没有考虑病人身高、体重、年龄、性别没有考虑手术切除范围 VC>50%预计值FEV1>50%预计值RV/TLC>50%预计值DLco>50%预计值缺点：没有考虑手术部位、手术范围安全手术的术前肺功能要求 预测开胸术后并发症最有意义的单项指标是术后预计FEV1%(PPO-FEV1%)其计算公式如下：PPO-FEV1%=术前FEV1%(1-切除的功能性肺组织所占的百分数)要求PPO-FEV1至少大于800ml或大于预计值的33%术后预测肺功能 切除的功能性肺组织所占百分数的估计方法分侧肺功能侧位肺功能同位素扫描 目前为大家所接受的保证肺叶切除术后长期存活的最低标准为FEV1%50%，PaCO250mmHgPPO-FEV1%40% 一氧化碳弥散DLCO计算肺切除术后的预计值，计算方法同ppoFEV1%ppoDLCO<40%预计值通常预示着较高的术后心肺系统并发症3.换气功能 4.动脉血气分析通常把不吸氧时PaO2<60mmHg或PaCO2>45mmHg作为禁忌肺切除术的界值但目前仍有低于该条件下成功进行手术的报道若手术能解除PaCO2升高或PaO2降低的原因，则PaCO2升高或PaO2降低不能成为预测PPCs的指标不同部位不同范围手术，标准应有所不同 5.心肺联合功能试验可精确控制患者的工作功率可进行多个生命体征监测，包括：心率、心电图、呼吸频率、作功量、氧耗量（VO2）、二氧化碳产生量（VCO2）、氧通气当量（VE/VO2）、二氧化碳通气当量（VE/VCO2）、动脉血乳酸、无氧阈等 登车运动方案（1）增量运动，空负荷登车，随后每隔1分钟运动负荷增加，直至运动极限（2）恒量运动固定运动负荷下登车，直至运动极限 无氧阈（AT）是出现由无氧代谢补充有氧代谢供能的位点，通常以此时的氧耗量表示 最大氧耗量（VO2max）是指患者运动-摄氧曲线进入平台期（即氧耗量不随运动功率的增加而上升）时的耗氧量。＞20ml/kg/min并发症0-10%＜10ml/kg/min并发症43-100% 心肺联合运动试验的绝对禁忌证近期内静息心电图出现明显的改变，提示心肌梗死或其它急性心脏事件近期内并发急性心肌梗死或不稳定心绞痛尚未控制的室性心律失常房性心律失常尚未得到控制，且引起心功能异常Ⅲ度房室传导阻滞，未安装起搏器 心肺联合运动试验的绝对禁忌证急性充血性心衰严重主动脉瓣狭窄可疑或已有主动脉夹层分离活动性或可疑的心肌炎和心包炎血栓性静脉炎或心内血栓形成近期内体循环或肺循环栓塞急性感染明显的精神萎靡，抑制 （1）肺动脉阻断试验阻断拟切除肺叶的肺动脉，如患者能耐受由此产生的肺动脉高压和低氧血症，则可胜任手术阻断后PaO2应不低于45mmHg，肺动脉压不高于35mmHg。（2）支气管扩张试验6.其它检查 术后发生PPCs危险的指标FVC<预计值的50%FEV1<预计值50%RV/TLC>预计值的50%DLco<预计值的50%MVV<预计值的50%或50L/min 戒烟药物治疗体疗减肥改善营养NPPV治疗三.术前准备措施 1.戒烟戒烟后12~24h血中CO及尼古丁水平下降48h后碳氧血红蛋白水平恢复正常48~72h后支气管粘膜纤毛功能提高1~2w后痰液分泌减少4~6w后肺功能有所改善6~8w后免疫功能恢复8~12w后吸烟对PPCs的近期影响解除 2.药物治疗舒张支气管、祛痰、分泌物引流抗感染掌握雾化吸入技术 训练咳嗽锻炼腹式呼吸呼吸肌锻炼3.术前体疗 一般在术前5-7天开始进行无创正压通气训练，呼吸模式多数采用PSV加或不加PEEP。每天2次，每次1-2小时4.无创正压通气（NPPV） 尽可能采用局部麻醉尽可能缩短外科手术时间尽可能减少肌松剂腹腔镜或胸腔镜手术并发症少四.术中措施 五.术后主要防治措施1.密切观察患者神志，呼吸2.监测PetCO2、SpO23.拮抗残余麻醉药物，对有呼吸中枢抑制者可用机械通气支持翻身拍背鼓励咳嗽5.早期活动和下床 6.疼痛治疗硬膜外镇痛静脉镇痛7.预防深静脉血栓形成8.营养支持9.雾化吸入五.术后主要防治措施 10.NPPV(1)患者临床上出现呼吸困难的征象，在明确无禁忌证之后即可应用。(2)具有高危因素的肺切除术患者，术后当天拔除气管导管后就可以开始间断无创正压通气支持采用PSV模式，压力支持水平8-10cmH2O，加或不加PEEP支持的时间和间隔应根据病人的治疗效果而定：少则一天2次，每次2小时；多则夜间全程支持，白天每间隔2小时支持2小时。五.术后主要防治措施'