最新微生物生产抗生素课件PPT.ppt 61页

'进入夏天，少不了一个热字当头，电扇空调陆续登场，每逢此时，总会想起那一把蒲扇。蒲扇，是记忆中的农村，夏季经常用的一件物品。　　记忆中的故乡，每逢进入夏天，集市上最常见的便是蒲扇、凉席，不论男女老少，个个手持一把，忽闪忽闪个不停，嘴里叨叨着“怎么这么热”，于是三五成群，聚在大树下，或站着，或随即坐在石头上，手持那把扇子，边唠嗑边乘凉。孩子们却在周围跑跑跳跳，热得满头大汗，不时听到“强子，别跑了，快来我给你扇扇”。孩子们才不听这一套，跑个没完，直到累气喘吁吁，这才一跑一踮地围过了，这时母亲总是，好似生气的样子，边扇边训，“你看热的，跑什么？”此时这把蒲扇，是那么凉快，那么的温馨幸福，有母亲的味道！　　蒲扇是中国传统工艺品，在我国已有三千年多年的历史。取材于棕榈树，制作简单，方便携带，且蒲扇的表面光滑，因而，古人常会在上面作画。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇诸名，实即今日的蒲扇，江浙称之为芭蕉扇。六七十年代，人们最常用的就是这种，似圆非圆，轻巧又便宜的蒲扇。　　蒲扇流传至今，我的记忆中，它跨越了半个世纪，也走过了我们的半个人生的轨迹，携带着特有的念想，一年年，一天天，流向长长的时间隧道，袅微生物生产抗生素 目录F红霉素的发酵生产D抗生素的提纯B抗生素的生物来源E青霉素的发酵工艺C抗生素产生菌的选育A抗生素定义 一.抗生素定义传统的定义：抗生素（antibiotic）是微生物细胞产生的能以低浓度抑制其他微生物细胞生长的化学物质。现代定义：抗生素是生物细胞（包括某些微生物﹑植物和动物）产生的能以低浓度抑制其他生物细胞生长或功能的化学物质。 微生物产生抗生素1、放线菌产生的抗生素：链霉菌属：放线菌素、链霉素等。小单抱菌属：红霉素（大环内酯类）、新霉素（氨基环醇类）诺卡氏菌属：肌霉素（氨基环醇类）、诺卡氏菌素放线菌中以链霉菌属产生的抗生素最多，诺卡菌属较少。 2、细菌产生抗生素芽孢杆菌属：多粘芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌假单胞菌属：铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）杆菌肽、粘杆菌素、多黏菌素等多肽类。3、真菌产生抗生素青霉属：青霉素、灰黄霉素。头孢菌属：头孢霉素 其他生物（动植物）产生抗生素植物产生的抗生素，如地衣和藻类植物产生的地衣酸和绿藻酸，从被子植物如蒜和番茄等植物的组织或果实中制得的蒜素和番茄素，裸子植物如银杏、红杉等也能产生抗生物质。动物的多种组织能产生溶菌酶或一些抗生素，如从动物的心、肺、脾、肾、眼泪、涎水中可提取出色素，有抗菌及抗病毒等作用。 三、抗生素产生菌的选育1、抗生素产生菌的分离2、抗菌性试验3、抗生素产生菌的改良1)人工诱变2)原生质体融合3)体外DNA重组 体外DNA重组 四、抗生素的提纯微生物在发酵过程中会产生多种代谢产物，包括各种初级代谢产物和次级代谢产物以及培养基的固有成分，这些成分的存在影响抗生素的使用效果，本身具有毒副作用，造成储存困难，必须经过精制。 ⑴抗生素提纯的基本步骤和原则3个基本步骤：发酵液过滤和预处理、粗纯化、精制4个原则：时间尽量短；采用适当较低浓度；条件适宜，pH适度，温度适宜；防止杂菌污染。⑵提取方法：吸附、萃取、离子交换、沉淀、色谱分离、分子筛过滤、透析等。抗生素的提纯 五、青霉素的发酵工艺 1、青霉素的作用机制、抗菌谱及稳定性作用机制：抑制细菌的转肽酶，阻止细胞壁合成中的交叉连接步骤，使处于繁殖分裂期的细菌细胞壁的合成发生障碍，导致菌体细胞壁损坏，使细胞内因渗透压等原因发生溶解而死亡。抗菌谱：作用于大多数革兰氏阳性细菌及部分革兰氏阴性细菌。稳定性：弱酸性的有机化合物，干燥纯净的青霉素盐很稳定，pH5-7，6最稳定。 2、菌种青霉素作为第一个具有临床应用价值的抗生素，1928年被发现，1943年在美国被首次实现工业生产。最早发现的产生青霉素的原始菌种是点青霉菌，生产能力很低，发酵单位2U/mL，不能满足工业生产要求，所以被淘汰。现在主要采用的是产黄青霉菌，目前国际上青霉素生产最高发酵单位80000-90000U/mL. 2、菌种生产菌种按其在深层培养中菌丝形态分为：丝状菌和球状菌；根据丝状菌产生孢子的颜色又分为黄孢子丝状菌和绿孢子丝状菌。常用菌种为绿孢子丝状菌，如产黄青霉菌。为了提高产黄青霉菌的青霉素产量，使用诱变剂如：二环氧丁烷、甲磺酸乙酯、乙烯亚胺、亚硝酸、X射线等。 3、当前青霉素的生产工艺流程一般而言，青霉素的生产工艺流程需要有四个环节。第一个环节是通过培养基配制、蒸汽灭菌等工艺手段将原料加工为一级种子罐。与此同时，还要将青霉素菌、斜面母瓶、米孢子等经过相应处理后加入到一级种子罐中。第二个环节是利用培养基配制和蒸汽灭菌等处理手段将原料培养成二级种子罐。第三个环节是在第二个环节的基础上加上发酵罐的处理，形成发酵液。最后一个环节则是将上述所获得的发酵液放在带放罐中，获得最终的发酵液，完成青霉素的发酵制备。 青霉素发酵工艺流程及发酵控制冷冻管孢子培养25℃,7天斜面母瓶孢子培养25℃,7天大米孢子种子培养27℃,50h1:3vvm一级种子培养液种子培养25℃,14h1:(1~1.5)vvm二级种子培养液变温发酵26-24℃200h1:(0.7~1.8)vvm发酵液 （1）孢子制备先将保存在砂土中的菌种孢子取出，在由甘油、葡萄糖以及蛋白胨所制备而成的培养基中进行斜面培养，经传代和活化。培养温度控制在26℃左右（最利于菌种孢子传代活化的适宜温度）。培养7d左右，得到单菌落之后，再传斜面，以同样的方式培养7d。然后就可以将所获得的斜面孢子移植到优质小米或大米固体培养基上，25℃，相对湿度45%-50%，培养7d，得到最终的生产孢子。所获得的生产孢子应该经过摇瓶试验后，确定其效价与杂菌情况均符合相关规定后方可用于下一环节生产。可在孢子成熟后进行真空干燥，低温保存备用。 一级种子发酵：发芽罐，孢子萌发，形成菌丝培养基：葡萄糖、玉米浆、碳酸钙、玉米油、消沫剂等。接种量：>200亿孢子/吨培养基空气流量：1：3（m3/m3·min）搅拌转速：300-350r/minpH：自然温度：27±1℃时间：40h（2）种子罐培养工艺 （2）种子罐培养工艺二级种子罐：繁殖罐，大量繁殖培养基：葡萄糖、玉米浆，玉米油，消沫剂等接种量：10%空气流量：1：1-1.5（m3/m3·min）搅拌转速：250-280r/minpH：自然温度：25±1℃时间：10-14h （3）生产罐培养工艺三级罐：发酵罐培养基：花生饼粉、葡萄糖、尿素、硝酸铵、硫代硫酸钠、苯乙酰胺、碳酸钙、玉米油、硅油温度控制：变温控制，不同阶段不同温度较高温度（26℃），缩短生长时间；降低温度（22℃），利于青霉素合成。pH：6.4-6.6左右根据pH补糖（补糖可是pH上升）空气流量:1:0.8-1.5（m3/m3·min）搅拌速度：150-200r/min 发酵罐示意图搅拌器冷却水进口放料口无菌空气培养液冷却水出口排气口pH检测及控制装置电动机加料口 菌丝生长速度与形态、浓度发酵稳定期，湿菌浓度可达15%-20%，丝状菌干重约3%，球状菌干重在5%左右。在发酵中后期一般每天放液一次，每次放掉总发酵液的10%左右。 消沫天然油脂：玉米油；化学消沫剂：泡敌前期：主间歇搅拌，少加油中期：搅拌、加油、稍微降低通气量（必要时，少量多次)后期：尽量少加消沫剂 青霉素的发酵过程控制十分精密，一般2小时取样一次，测定发酵液的pH、菌浓、残糖、青霉素效价等指标，同样取样做无菌检测，发现染菌立即结束发酵，视情况过滤提取，因为染菌后pH波动大，青霉素在几小时内就会被全部破环。 (4)青霉素的提取工艺青霉素不稳定，遇酸、碱、热分解失活水溶液中不稳定，非极性溶剂中稳定易溶于有机溶剂，水中溶解度很小青霉素盐很稳定；降解产物具有致敏性防止降解，条件温和、快速 青霉素的提取工艺发酵液预处理→萃取→脱色→反萃取→过滤洗涤→干燥（发酵液中，青霉素浓度较低10-30kg/m3）①发酵液预处理：浓缩目的产物，去除大部分杂志，改变发酵液的流变学特征，利于后续的分离纯化过程a.加絮凝剂使蛋白质沉淀b.过滤（鼓式真空过滤机）活性炭 ②萃取工艺过程：二级逆流萃取A、萃取原理：分配定律，青霉素在水中溶解度小，易溶于醋酸丁酯、醇等有机溶剂中，青霉素盐易溶于水，不溶于有机溶剂。青霉素在滤液中以盐存在，加入酸和醋酸丁酯，溶于有机相中，在醋酸丁酯中加入碳酸钾，6.8-7.4，形成盐转入水相中，实现反萃取。 B、影响萃取因素pH：反复调节pH，青霉素不稳定，易发生降解、异构化、重排，β-内酰胺环是功能性。温度：加热会加快其降解反应工艺过程及浓缩倍数，级数越高、纯度越高但收率越低。微生物污染：杂菌：β-内酰胺酶和青霉素酰胺酶萃取时间：青霉素在水中的半衰期18.5min。 (5)青霉素的精制制成碱金属盐：碱金属盐稳定性大；青霉素在水中的稳定性差，水解快。1)结晶工艺：A、醋酸丁酯中直接结晶：加入醋酸钾--乙醇--碳酸钾、丁醇--水真空共沸蒸馏。B、丁醇-水共沸结晶：青霉素的碱金属盐溶于水，在丁醇中不溶解，稳定，丁醇和水形成二元共沸物蒸出，丁醇带出水分，不断加入丁醇，可使水分不断减少，结晶析出。2)过滤、洗涤、干燥结晶后用真空抽滤来处理母液，并用丁醇洗涤。干燥采用真空双锥旋转干燥器 (6)溶媒回收采用立式传质塔蒸馏回收。 一、斜面培养：淀粉1％，硫酸铵0.3％、玉米粉0.6～1.0％、氯化钠0.3％、蛋白胨0.2％、琼脂2％、pH7.0～7.237℃培养7～10d，成熟的孢子灰色略带微红色。一级种子培养：豆饼粉2.5％、葡萄糖3％、淀粉4％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.5％、硫酸铵0.5％、％、玉米粉0.2％、氯化钠0.3％、磷酸氢二钾0.06％、硫酸镁0.025％、豆油0.3％35℃培养72h，菌丝密集六、红霉素的发酵生产 二级种子：豆饼粉2.2％、葡萄糖3％、淀粉4％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.5％、硫酸铵0.1％、玉米粉0.8％、氯化钠0.3％、碳酸钙0.6％、豆油0.3％35℃，24h，接种量10％二、发酵罐培养发酵培养基：豆饼粉2.4％、葡萄糖3％、3.5％、蛋白胨0.5％、酵母粉0.5％、硫酸铵0.1％、玉米粉0.8％、氯化钠0.3％、碳酸钙0.6％、豆油0.15％，丙酸0.6％（分次加入）60h前35℃，60h后33℃ 菌丝繁殖期：接种45h后，菌丝生长快，繁殖旺盛，迅速利用N、C，菌丝体密集成网状。红霉素分泌期：45h～150h，菌丝体生长减弱，并达到平衡，pH在7.2左右，c源利用较快，红霉素持续分泌。菌丝自溶期：菌体衰老，发酵液颜色较深，菌丝短，粘稠度较大，pH上升7.5，氨基氮上升。 三、红霉素的提取和精制红霉素是一种有机碱化物，在碱性条件下溶于有机溶剂中，在酸性条件下溶于水中。 提取工艺发酵液过滤滤液酸化液加甲醛、硫酸锌pH8.2～8.8(26000r/ml)加氢氧化钠静止碱化调节pH10～10.5分层、离心醋酸调节pH5～5.5静止分层酸化液5℃加丙酮冷冻结晶结晶洗涤干燥成品 1、发酵液预处理0.1～0.2％甲醛：杀菌使蛋白凝集变性4～6硫酸锌：去除酸性蛋白，助滤并用碱液调节pH8.2～8.8，稳定红霉素2、滤液处理计算添加醋酸丁酯添加量，用碱液调节pH10～10.5，30～33℃左右，红霉素溶解于有机溶剂中。气流干燥80-90ºC 3、醋酸丁酯液处理：10％醋酸调节pH5～5.5，分层，去除醋酸丁酯液，在酸性环境下溶于水溶液中分层过滤酸液处理用10％氢氧化钠调节pH7～8，再加适量的醋酸丁酯，二次萃取。静止分层最终得到溶解于水中的红霉素再经过冷冻结晶，真空干燥得纯品。 Thanks! 脑血管意外后遗症认定标准海南省农垦三亚医院神经内科何超明 内容1、脑血管意外（脑梗塞、脑出血）定义2、脑血管意外后遗症的定义3、脑血管意外后遗症的表现4、脑血管意外后遗症认定标准5、脑血管意外后遗症诊疗范围 一、脑血管意外的定义脑血管意外又叫脑卒中（Stroke）是脑中风的学名，是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病。是指在脑血管病的病人，因各种诱发因素引起脑内动脉狭窄，闭塞或破裂，而造成急性脑血液循环障碍，临床上表现为一次性或永久性脑功能障碍的症状和体征。脑血管意外包括：1、出血性：脑出血；蛛网膜下腔出血2、缺血性：脑梗塞（脑血栓形成、脑栓塞、短暂性脑缺血发作（TIA）） 一、脑血管意外（脑出血）的诊断脑出血主要是高血压性脑出血，也包括其他病因的非外伤性脑内出血。高血压性脑出血的诊断要点如下。1.常于体力活动或情绪激动时发病。2.发作时常有反复呕吐、头痛和血压升高。3.病情进展迅速，常出现意识障碍、偏瘫和其他神经系统局灶症状。4.多有高血压病史。5.CT应作为首选检查。6.腰穿脑脊液多含血和压力增高（其中20%左右可不含血）。中华医学会第四届全国脑血管病学术会议.各项脑血管病诊断要点[J].中华神经内科杂志,1996,29(6):379. 一、脑血管意外（脑梗塞）的诊断脑梗塞：动脉粥样硬化性血栓性脑梗塞（1）常于安静状态下发病。（2）大多数发病时无明显头痛和呕吐。（3）发病较缓慢，多逐渐进展或呈阶段性进行，多与脑动脉粥样硬化有关，也可见于动脉炎、血液病等。（4）一般发病后1~2天内意识清楚或进度障碍。（5）有颈内动脉系统和（或）椎-基底动脉系统症状和体征。（6）应作CT或MRI检查。（7）腰穿脑脊液一般不应含血。中华医学会第四届全国脑血管病学术会议.各项脑血管病诊断要点[J].中华神经内科杂志,1996,29(6):379. 脑血管意外（脑栓塞）的诊断脑栓塞（1）多为急骤发病。（2）多数无前驱症状。（3）一般意识清楚或有短暂性意识障碍。（4）有颈内动脉系统和（或）椎-基底动脉系统症状和体征。（5）腰穿脑脊液一般不应含血，若有红细胞可考虑出血性脑梗塞。（6）栓子的来源可分为心源性或非心源性，也可同时伴有其他脏器、皮肤、粘膜等栓塞症状。中华医学会第四届全国脑血管病学术会议.各项脑血管病诊断要点[J].中华神经内科杂志,1996,29(6):379. 脑血管意外（腔隙性梗塞）的诊断腔隙性梗塞（1）发病多由于高血压动脉硬化引起，呈急性或亚急性起病。（2）多无意识障碍。（3）应进行CT或MRI检查，以明确诊断。（4）临床表现都不严重，较常见的为纯感觉性卒中、纯运动性请偏瘫、共济失调性轻偏瘫，构音不全-手笨拙综合征或感觉运动性卒中等。（5）腰穿脑脊液无红细胞。中华医学会第四届全国脑血管病学术会议.各项脑血管病诊断要点[J].中华神经内科杂志,1996,29(6):379. 二、脑血管意外后遗症的定义脑血管意外（脑梗塞、脑出血）后遗症的定义是指在脑血管意外发病半年到一年后，还存在半身不遂或者语言障碍或口眼歪斜等症状，就叫做脑中风后遗症。该时期也叫做脑血管意外后遗症期，与恢复期相比，恢复速度及程度很慢。 三、脑血管意外后遗症临床表现脑血管意外后遗症主要有1、偏瘫（半身不遂）、半侧肢体障碍、肢体麻木、四肢瘫；面瘫，口瘫（吞咽困难、饮食呛咳）；2、偏盲、失明；3、失语。感觉性失语（听不懂，能讲，所讲无意义）运动性失语（听懂不能讲）、构语困难；4、感觉障碍；5、共济失调；6、耳聋；7、智能障碍； 四、脑血管意外后遗症认定标准（一）1、病史资料：明确诊断为脑出血或脑梗塞病史；2、有急性脑血管病史并经CT或MRI证实；3、脑血管意外发病半年以上 四、脑血管意外后遗症认定标准（二）3.合并下列各项症状之一：（1）偏瘫肌力4级或以下；（2）截瘫肌力4级或以下；（3）单手部分肌瘫肌力3级或以下；（4）双足部分肌瘫肌力3级或以下；（5）单足全肌瘫肌力3级或以下；（6）非肢体瘫的中度运动障碍；（7）语言障碍，吐字不清或智力障碍；（8）其他神经功能缺损的症状。 四、认定标准解析：肌力分级肌力分级0级肌肉完全麻痹，触诊肌肉完全无收缩力；1级肌肉有主动收缩力，但不能带动关节活动（可见肌肉轻微收缩）；2级可以带动关节水平活动，但不能对抗地心引力（肢体能在床上平行移动）；3级能对抗地心引力做主动关节活动，但不能对抗阻力肢体可以克服地心吸收力，能抬离床面；4级能对抗较大的阻力，但比正常者弱（肢体能做对抗外界阻力的运动）：5级正常肌力（肌力正常，运动自如）。 四、认定标准（解析）认定标准合并下列各项症状之（8）其他神经功能缺损的症状。解析：1、共济失调、行走不稳、影响生活的震颤、强直、舞蹈症状等2、偏盲、失明；3、失语。感觉性失语（听不懂，能讲，所讲无意义）运动性失语（听懂不能讲）、构语困难；4、感觉障碍；5、耳聋； 四、认定标准（解析）认定标准合并下列各项症状之（6）非肢体瘫的中度运动障碍；解析：共济失调、行走不稳、影响生活的震颤、强直、舞蹈症状等 五、脑血管意外后遗症诊疗范围1.脑血管疾病原发疾病的药物治疗（如降压、抗凝、降脂改善脑功能缺损等）；原发病可能包括：高血压、糖尿病、高血脂、同型半胱氨酸高、脑动脉硬化或狭窄。2.后遗症及并发症的对症治疗；3.治疗期间及治疗后的相关检查。 五、脑血管意外后遗症诊疗范围2.后遗症及并发症的对症治疗；后遗症包括：偏瘫、失语、智能障碍等并发症对症治疗：吸入性肺炎、褥疮、消化道出血、泌尿系感染等 五、脑血管意外后遗症诊疗范围3.治疗期间及治疗后的相关检查。包括：化验血常规、血糖、血脂、生化等影像检查：CTMR心电图、超声、脑电图等。 谢谢！'