最新第十五章-比色法和分光光度法课件PPT.ppt 150页

'第十五章-比色法和分光光度法 15.1概述15.2光吸收的基本定律15.3比色法和分光光度法及其仪器15.4显色反应与显色条件的选择15.5分光光度法仪器测量误差及其消除15.6分光光度法的某些应用基本内容2 学习要求了解比色法、分光光度法的特点。掌握光的吸收定律及其适用范围。掌握分光光度法的分析方法。了解显色反应及其条件的选择。了解分光光度法仪器测量的误差及测量条件的选择。了解分光光度法的某些应用。3 二、物质对光的选择性吸收1.光的基本性质电磁辐射按波长顺序排列，称电磁波谱。γ射线→X射线→紫外光→可见光→红外光→微波→无线电波γ射线能量最高，来源于核能级跃迁χ射线来自内层电子能级的跃迁高能辐射区来自原子和分子外层电子能级的跃迁紫外光可见光红外光来自分子振动和转动能级的跃迁光学光谱区微波来自分子转动能级及电子自旋能级跃迁无线电波来自原子核自旋能级的跃迁波谱区7 光学光谱区(Spectralregion)(真空紫外)远红外中红外近红外可见近紫外远紫外10nm~200nm中层电子200nm~400nm价电子400nm~750nm价电子760nm~2.5m分子振动2.5m~5.0m分子振动5.0m~1000m分子转动肉眼可见8 单色光：只具有一种波长的光。复合光：由两种以上波长组成的光，如白光。白光（如日光）是复合光，是由红、橙、黄、绿、青、蓝、紫等光按适当的强度比例混合而成的，在400nm～750nm范围的一种复合光。2、物质对光的选择性吸收当光通过透明的物质时，具有某种能量的光子被吸收，而另外能量的光子不被吸收。光子是否被物质吸收，既决定于光子的能量，又决定于物质的内部结构。9 仅当照射光的光子的能量与被照射物质粒子的基态和激发态的能级差相当时才能被光吸收。基态激发态E1E2M+h→M*M+热M+荧光或磷光分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同。互补光：透射光与吸收光组成白光，故称为互补色光10 互补色光11 /nm颜色互补光400-450紫黄绿450-480蓝黄480-490绿蓝橙490-500蓝绿红500-560绿红紫560-580黄绿紫580-610黄蓝610-650橙绿蓝650-760红蓝绿不同颜色的可见光波长及其互补光12 物质的颜色：是由于物质对不同波长的光具有选择性的吸收作用而产生的。即物质的颜色由透过光的波长决定溶液的颜色：被吸收光色的互补色13 例：高锰酸钾溶液因吸白光中的绿色光而呈紫色。例：硫酸铜溶液因吸白光中的黄光而呈蓝色。若溶液对白光中的各种颜色的光都不吸收呈无色透明。14 3、吸收光谱或吸收曲线吸收曲线：测定某种物质对不同波长单色光的吸收程度，以波长为横坐标，吸光度为纵坐标作图。400480560640720λnm0.40.81.21.6AKMnO4溶液的吸收曲线DCBAA、B、C、D代表不同浓度下的吸收曲线。λmax15 （1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax。（2）对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同。（3）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。吸收曲线的讨论16 （4）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度A有差异，在λmax处吸光度A的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。17 15.2光吸收的基本定律一、朗伯-比尔定律1、朗伯—比尔定律IrIoItIa一束平行单色光照射透明溶液时，光的一部分被吸收，一部分透过溶液，一部分被器皿的表面反射。18 ①.朗伯定律(Lambert’slaw)②.比尔定律(Beer’slaw)A：吸光度19 ③、朗伯-比尔定律A=lg(I0/It)=KbcA—吸光度(absorbance)b—介质厚度(length/cm)c—浓度(concentration)K—吸光系数(absorptivity)T－透光度(Transmittance)A=lg(I0/It)=lg(1/T)=-lgT=KbcT:透过光强度It与入射光强度Io之比。20 2、比例常数K①吸光系数a当c用g·L-1表示，b用cm表示时，K用a表示，称为吸光系数，其单位为L·(g.cm)-1，则：A=abc②摩尔吸光系数κ当c用mol·L-1表示，b用cm表示时，K用κ表示，称为摩尔吸光系数，其单位为L·mol-1.cm-1。则：A=κbcκ在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。21 κ越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。κ>105：超高灵敏；κ=(6～10）×104：高灵敏；κ<2×104：不灵敏。桑德尔(Sandell)灵敏度(灵敏度指数)用S来表示。S是指当仪器的检测极限A=0.001时，单位截面积光程内所能检测出来的吸光物质的最低含量，其单位为ug·cm-2，S与κ及吸光物质摩尔质量M的关系为：S=M/κ分光光度的灵敏度κ与温度、波长及吸收物质本身的性质有关，与吸收物质浓度无关。22 【例】：有一浓度为1.0g/mlFe2+的溶液，以邻二氮菲显色后，在比色皿厚度为2cm、波长510nm处测得吸光度为0.380，计算（1）透光度T；(2)吸光系数a；（3）摩尔吸光系数κ。解（1）T＝10-A＝10-0.380＝0.417（2）（3）a与κ的关系为：κ=aM（M为摩尔质量）23 二、吸光度的加合性A总=∑Ai=κ1b1c1+κ2b2c2+……κnbncn总的吸光度等于各个吸光物质的吸光度之和。或溶液的吸光度应等于溶液中各组分的吸光度之和。（组分间没有干扰）A4A3A2A124 溶液中多组分测定25 三、对朗伯-比尔定律的偏离CA标准工作曲线图正误差负误差②散射光的影响胶体、乳浊液或悬浊液由于散射的作用使吸光度增大，或入射光不是垂直通过比色皿产生正偏差。1、物理因素①单色光不纯，导致负偏差26 ①吸光质点的相互作用，浓度较大时，产生偏差，朗伯-比尔定律只适合于稀溶液（c<10-2mol·L-1)。②平衡效应，物质的离解、缔合、互变异构及化学变化引起的偏离，如：Fe(SCN)3=Fe3++3SCN-Cr2O72-+H2O=2CrO42-+2H+二、化学因素27 一、目视比色法12345标准系列溶液待测溶液15.3比色法和分光光度法及其仪器用眼睛比较溶液颜色深浅以确定物质含量。（也叫标准色阶法）28 目视比色法的优点是1、仪器简单，操作简便，适宜于大批试样分析。2、灵敏度较高，适宜于稀溶液中微量元素的测定。3、白光下进行测定，因此有些显色反应不符合朗伯——比耳定律时，仍可用目视法测定。目视比色法的缺点是：1、有色溶液一般不太稳定，常常临时配制一套标准色阶，较麻烦费时。2、依靠人的眼睛来观察颜色深度，有主观误差，准确度不高，相对误差约为5～20%。29 二、分光光度计(spectrophotometer)通过棱镜或光栅得到一束近似的单色光.波长可调,故选择性好,准确度高.光源单色器吸收池检测系统稳压电源分光光度法的基本部件：读数指示器30 分光光度计内部光的传播途径31 1.光源(Lightsource)：发出所需波长范围内的连续光谱，有足够的光强度,稳定。可见光区：钨灯，碘钨灯(320～2500nm)紫外区：氢灯，氘灯(180～375nm)2.单色器(monochromator)：将光源发出的连续光谱分解为单色光的装置。棱镜光栅玻璃350～3200nm,石英185～4000nm32 3.吸收池(cell):用于盛待测液及参比溶液。玻璃—能吸收UV光，仅适用于可见光区石英—不吸收紫外光，适用于紫外和可见光区要求：匹配性（对光的吸收和反射应一致）4.检测器(detector)：利用光电效应，将光能转成电流讯号。光电池，光电管，光电倍增管33 5.读数指示器把光电流放大的信号以适当方式显示或记录下来。通常使用悬镜式光电反射检流计测定产生的光电流。检流计光点偏转刻度直接标为吸光度和透光度，测定时一般可直接读出吸光度。34 35 36 37 38 5.4显色反应与显色条件的选择显色反应在分光光度分析中，利用显色反应把待测组分M转变为有色化合物MR，然后再进行测定。使试样中的被测组分与化学试剂作用生成有色化合物的反应叫显色反应。所用试剂称显色剂。M(待测物)＋nR(显色剂)＝MRn(有色化合物)显色反应主要有配位反应和氧化还原反应，其中绝大多数是配位反应。39 一、对显色反应的要求1、灵敏度高选择κ较大的显色反应（一般要为104~105）。避免共存组分干扰。2、选择性好显色剂只与被测组分反应。3、有色物组成固定Fe3++磺基水杨酸→三磺基水杨酸铁(黄色)（组成固定）Fe3++SCN-→FeSCN2+、Fe(SCN)2+……（组成不固定）40 4、有色物稳定性高，其它离子干扰才小。如三磺基水杨酸铁的Kf=1042,F-、H3PO4对它无干扰。5、显色过程易于控制，而且有色化合物与显色剂之间的颜色差别应尽可能大。41 二、显色反应条件的选择（实验确定）1、显色剂的用量，适当过量M+R=MR(被测组分)(显色剂)(有色化合物)R过量，反应完全，MR稳定，A值稳定。42 cRcRcR适宜的用量通过实验求得(cM、pH一定)吸光度A与显色剂用量cR的关系会出现如图所示的几种情况。选择曲线变化平坦处。43 （1）对金属离子的影响（2）对显色剂浓度的影响（3）影响配合物组成（4）配合物的稳定性的影响（5）影响显色剂的颜色2.酸度M+L=ML44 （cM、cR一定）pH180g／L或球蛋白>35g／L，称为高蛋白血症或高球蛋白血症。总蛋白增高主要是球蛋白增高，其中又以γ球蛋白增高为主，常见原因①慢性肝脏疾病：慢性肝炎、肝硬化、酒精性肝病等。球蛋白增高程度与肝脏病严重性相关。②M蛋白血症：多发性骨髓瘤、淋巴瘤、原发性巨球蛋白血症等。③自身免疫性疾病：系统性红斑狼疮、风湿热、④慢性炎症与慢性感染：如结核病、疟疾、黑热病、麻风病及慢性血吸虫病等。3．总蛋白及球蛋白增高 4．球蛋白降低主要是合成减少，①生理性减少：小于3岁的婴幼儿；②免疫功能抑制：长期应用肾上腺皮质激素或免疫抑制剂；③先天性低γ球蛋白血症。5．A／G倒置可以是清蛋白降低或球蛋白增高，见于严重肝功能损伤及M蛋白血症，如慢性肝炎、肝硬化、原发性肝癌、多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症等。 (二)血清蛋白电泳清蛋白0.62～0.71(62％～71％)α1球蛋白0.03～0.04(3％～4％)α2球蛋白0.06～0.10(6％～10％)β球蛋白0.07～0.11(7％～11％)γ球蛋白0.09～0.18(9％～18％)[参考值范围]醋酸纤维素膜法 [临床意义]1肝脏疾病急性及轻症肝炎时电泳结果无异常。慢性肝炎、肝硬化、肝癌，清蛋白减少、α1、α2、β球蛋白也减少；γ球蛋白增加，在慢性活动性肝炎和失代偿的肝炎后肝硬化增加尤为显著。 2．M蛋白血症如骨髓瘤、原发性巨球蛋白血症等，清蛋白轻度降低，γ球蛋白明显升高。3．肾病综合征、糖尿病肾病由于血脂增高，可致β球蛋白(是脂蛋白的主要成分)增高，清蛋白及γ球蛋白降低。4．其他结缔组织病伴有γ球蛋白增高，先天性低丙种球蛋白血症球蛋白降低，蛋白丢失性肠病表现为清蛋白及γ球蛋白降低，α2球蛋白则增高。 （三）血清前清蛋白测定[原理]前清蛋白(prealbumin)在肝细胞合成，在电泳图谱上位于清蛋白前方，是一条染色很浅的区带。前清蛋白是一种载体蛋白，能与甲状腺素结合，因此又叫甲状腺素结合前清蛋白(thyroxinebindingprealbumin)，并能运输维生素A。前清蛋白半衰期较其他血浆蛋白短(约2天)，因此它比清蛋白更能早期反映肝细胞损害。它的血清浓度明显受营养状况及肝功能改变的影响，常用放射免疫扩散法测定。 [参考值范围]1岁100mg／L1～3岁168～281mg／L成人280—360mg／L [临床意义]1.降低①营养不良、慢性感染、晚期恶性肿瘤；②肝胆系统疾病：肝炎、肝硬化、肝癌及胆汁淤积性黄疽。对早期肝炎、急性重症肝炎有特殊诊断价值。2.增高见于Hodgkin病。 （四）血浆凝血因子测定凝血因子几乎都在肝脏中合成，凝血因子半衰期比清蛋白短得多，尤其是维生素K依赖因子(Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、X)，如因子Ⅶ的半衰期只有1.5--6小时，因此在肝功能受损的早期，清蛋白检测完全正常，而维生素K依赖的凝血因子却有显著降低，故在肝脏疾病早期可用凝血因子检测作为过筛试验。 在肝脏疾患时，通常进行的过筛试验有：1.凝血酶原时间(PT)测定它反映血浆因子Ⅱ、V、Ⅶ、X含量，PT延长是肝硬化失代偿期的特征，也是诊断胆汁淤积，肝脏合成维生素K依赖因子Ⅱ、Ⅶ、X是否减少的重要实验室检查。在暴发性肝炎时，如PT延长、纤维蛋白原及血小板都降低，可诊断为DIC。2．活化部分凝血活酶时间测定(APTT)严重肝病时，因子Ⅸ、X、Ⅺ、Ⅻ合成减少，致使APTT延长；维生素K缺乏时，因子Ⅸ、X不能激活，APTT亦可延长。 3．凝血酶凝固时间(TT)测定TT延长主要反应血浆纤维蛋白原含量减少或结构异常和FDP的存在，因子Ⅶ、Ⅸ、X也有影响。肝硬化或急性暴发性肝功能衰竭合并DIC时，TT是一个常用的检测手段。4．肝促凝血酶原激酶试验(HPT)HPT能反映因子II、Ⅶ、X的综合活性，试验灵敏度高，但由于其灵敏度太高，故与预后相关性较差。5．抗凝血酶Ⅲ(AT-Ⅲ)测定AT-Ⅲ主要在肝脏合成，70％一80％凝血酶由其灭活，它与凝血酶形成1：1共价复合物而抑制凝血酶。严重肝病时AT-Ⅲ活性明显降低，合并DIC时减低更显著。 （五）血氨测定[原理]来源：1、肠道中未被吸收的氨基酸及未消化的蛋白质在大肠杆菌作用下脱去氨基生成氨。2、血液中的尿素渗入肠道，经大肠杆菌分解作用生成氨。氨对中枢神经系统有高度毒性。肝脏是唯一能解除氨毒性的器官，肝脏将氨合成尿素，是保证血氨正常的关键，严重肝损害时，如果80％以上肝组织破坏，氨就不能被解毒，在中枢神经系统积聚，引起肝性脑病。 [参考值范围]谷氨酸脱氢酶法11—35μmol／L[临床意义]1．升高①生理性增高见于进食高蛋白饮食或运动后；②病理性增高见于严重肝损害(如肝硬化、肝癌、重症肝炎等)、上消化道出血、尿毒症及肝外门脉系统分流形成等。2．降低低蛋白饮食、贫血。 二、脂类代谢功能检查血清脂类包括胆固醇、胆固醇酯、磷脂、甘油三酯及游离脂肪酸。肝脏除合成胆固醇、脂肪酸等脂类外，还能利用食物中脂类及脂肪组织的游离脂肪酸，合成甘油三酯及磷脂，血液中的胆固醇及磷脂主要来源于肝脏。当肝细胞损伤时，脂肪代谢发生异常，因此测定血浆脂蛋白及脂类成分，尤其是胆固醇及胆固醇脂的改变，是估计肝脏对脂类代谢功能的重要手段。 (一)血清胆固醇和胆固醇酯[原理]内源性胆固醇80％由肝脏合成。当肝细胞损伤时，胆固醇合成减少，由于LCAT的减少或缺乏，导致胆固醇酯的含量减少。 [参考值范围]总胆固醇2.9—6.0mmol／L胆固醇酯2.34—3.38mmol／L胆固醇酯：游离胆固醇=3：1 [临床意义]1．肝细胞受损时，胆固醇的酯化障碍，胆固醇酯减少。肝细胞严重损害如肝硬化、暴发性肝功能衰竭时，血中总胆固醇也降低。2．胆汁淤积由于胆汁排出受阻而反流入血，血中出现阻塞性脂蛋白X，同时肝合成胆固醇能力增加，血中总胆固醇增加，其中以游离胆固醇增加为主。3．营养不良及甲状腺功能亢进症患者，血中总胆固醇减少。 (二)阻塞性脂蛋白X测定[原理]当胆道阻塞胆汁淤积时，由于胆汁排泄受阻，胆汁内的磷脂逆流入血，血中出现大颗粒脂蛋白，称为阻塞性脂蛋白X(LP-X)，它是一种异常的低密度脂蛋白。[参考值范围]正常血清中LP-X为阴性 [临床意义]1．胆汁淤积性黄疸的诊断血清LPX阳性有助于胆汁淤积性黄疸的诊断。2．肝内、外阻塞的鉴别诊断LP-X的定量与胆汁淤积程度相关，肝外阻塞比肝内阻塞引起胆汁淤积程度严重，一般认为其定量>2000mg／L，提示肝外胆道阻塞。 三、胆红素代谢检查胆红素是血液循环中衰老红细胞在肝、脾及骨髓中分解破坏的产物。红细胞破坏释放出血红蛋白，代谢生成珠蛋白和血红素，血红素经氧化作用，生成胆绿素，进一步被催化而还原为胆红素。 正常人由红细胞破坏生成的胆红素占总胆红素的80％一85％，其余15％一20％来自肌红蛋白、过氧化氢酶及细胞色素酶及骨髓中无效造血的血红蛋白，以上形成的胆红素称为游离胆红素(freebilirubin)，在血流中与清蛋白结合形成的复合体，称为非结合胆红素(unconjugatedbilirubin)，非结合胆红素不能自由透过各种生物膜，故不能从肾滤过。 非结合胆红素经肝脏代谢形成结合胆红素，结合胆红素随胆汁排入肠道，在肠道细菌作用下，生成尿胆原(urobilinogen)，大部分随粪便排出，约20％的尿胆原被肠道重吸收，经门脉入肝，重新转变为结合胆红素，再随胆汁排入肠腔，这就是胆红素的肠肝循环。 当红细胞破坏过多(溶贫)、肝细胞膜对胆红素转运缺陷(Gilbert综合征)、结合缺陷((Criglerr-Najjar综合征)、排泄障碍(Dubin-johnson综合征)及胆道阻塞(各型肝炎、胆管炎症等)均可引起胆红素代谢障碍，临床上通过检测血清总胆红素、结合胆红素、非结合胆红素、尿内胆红素及尿胆原，借以诊断有无溶血及判断肝、胆系统在胆色素代谢中的功能状态。 (一)血清总胆红素测定[参考值范围]新生儿0~1天34~103μmol／L1~2天103~171μmol／L3~5天68~137μmol／L成人3.4～17.1μmol／L [临床意义]1．判断有无黄疸、黄疸程度及演变过程STB>17.1但<34.2μmol／L为隐性黄疸。34.2—171μmol／L为轻度黄疸。171—342μmol／L为中度黄疸。>342μmol／L为高度黄疸。2．根据黄疸程度推断黄疸病因溶血性黄疸通常<85.5μmol／L，肝细胞黄疸为17.1—171。不完全性梗阻为171~265μmol／L。完全性梗阻性黄疸通常>342μmol／L。 3．总胆红素，结合及非结合胆红素升高程度判断黄疸类型总胆伴非胆明显增高提示为溶血性黄疸，总胆伴结胆升高为胆汁淤积性黄疸，三者均增高为肝细胞性黄疸。 (二)血清结合胆红素与非结合胆红素测定[参考值范围]结合胆红素0～6.8μmol／L非结合胆红素1.7～10.2μmol／L [临床意义]根据结合胆红素与总胆红素比值，可协助鉴别黄疸类型：CB／STB<20％提示为溶血性黄疸，20％～50％之间为肝细胞性黄疸，>50％为胆汁淤积性黄疸。结合胆红素测定有助于某些肝胆疾病的早期诊断，肝炎的黄疸前期、无黄疸型肝炎、失代偿期肝硬化、肝癌等，30％～50％患者CB增加，而STB正常。 (三)尿内胆红素检查[原理]非结合胆红素不能透过肾小球屏障，因此不能在尿中出现，而结合胆红素为水溶性能够透过肾小球基底膜在尿中出现。正常成年人尿中含有微量胆红素，大约为3.4μmol／L，通常的检验方法不能被发现，当血中结合胆红素浓度超过肾阈(>34μmol／L)时，结合胆红素可自尿中排出。 [参考值]正常为阴性反应。[临床意义]尿胆红素试验阳性提示血中结合胆红素增加，见于：1．胆汁排泄受阻肝外胆管阻塞，如胆石症、胆管肿瘤、胰头癌等，肝内小胆管压力升高如门脉周围炎症、纤维化，或因肝细胞肿胀等。 2．肝细胞损害如病毒性肝炎，药物或中毒性肝炎，急性酒精性肝炎。3．黄疸鉴别诊断肝细胞性及梗阻性黄疸尿内胆红素阳性而溶血性黄疽疸则为阴性。先天性黄疸中Dubin-Johnson和Rotor综合征尿内胆红素阳性，而Gilbert和Crigler-Najjar综合征则为阴性。4．碱中毒时胆红素分泌增加，可出现尿胆红素试验阳性。 (四)尿内尿胆原检查[原理]在胆红素肠肝循环过程中，仅有极少量尿胆原逸入血液循环，从肾脏排出。[参考值范围]定量0.84—4.2μmol／24h定性阴性或弱阳性 [临床意义]尿内尿胆原在生理情况下仅有微量，若晨尿稀释4倍以上仍呈阳性，则为尿胆原增多。1．尿胆原增多①肝细胞受损，如肝炎，肝硬化。②红细胞破坏增加，如溶贫及巨幼贫。③内出血时胆红素生成增加，尿胆原随之增加；心力衰竭伴肝淤血时，影响胆汁中尿胆原转运及再分泌，进入血中的尿胆原增加。④其他，如肠梗阻、顽固性便秘，使肠道对尿胆原回吸收增加，使尿中尿胆原排出增加。 2．尿胆原减少或缺如①胆道梗阻，如胆石症、胆管肿瘤、胰头癌、Vater壶腹癌等，完全梗阻时尿胆原缺如，不完全梗阻时则减少，同时伴有尿胆红素增②新生儿及长期服用广谱抗生素时，由于肠道细菌缺乏或受到药物抑制，使尿胆原生成减少。临床通过血中结合胆红素、非结合胆红素测定及尿内尿胆红素、尿胆原的检查对黄疸诊断与鉴别诊断有重要价值。 正常人及常见黄疸的胆色素代谢检查结果 肝脏是人体含酶最丰富的器官，酶蛋白含量约占肝总蛋白含量的2/3。但常用于临床诊断不过10余种。有些酶具有一定组织特异性，根据酶活性测定可用于诊断肝胆疾病。如肝细胞损伤时细胞内的酶释放入血流，使血清中酶活性升高，如丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、醛缩酶、乳酸脱氢酶(LDH)。有些酶是由肝细胞合成，当患肝病时，这些酶活性降低，如凝血酶。四、血清酶及同工酶检查 一些凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、X合成需维生素K参与，维生素K在肠道的吸收依赖于胆汁酸盐，当胆汁淤积时这些酶合成不足。肝脏和某些组织合成的酶释放到血液中，从胆汁中排出，当胆道阻塞时，排泄受阻，致使血清中这些酶的活性升高，如碱性磷酸酶(ALP)、γ—谷氨酰转肽酶(γ-GT)。有些酶活性与肝纤维组织增生有关，当肝脏纤维化时，这些酶活性增高，如单胺氧化酶(MAO)，Ⅲ型前胶原肽(PⅢP)、透明质酸(HA)、脯氨酰羟化酶(PH)等。因此，血清中的酶活性变化能反映肝脏的病理状态，是肝脏病实验室检查中最活跃的一个领域。 (一)血清氨基转移酶及其同工酶测定1．血清氨基转移酶用于肝功能检查主要有2种丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferases，ALT，GPT)天门冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferases，AST，GOT) ALT与AST在正常血清的含量很低，但肝细胞受损时，肝细胞膜通透性增加，胞浆内的ALT与AST释放入血浆，使血清ALT与AST活性升高，在中度肝细胞损伤时，ALT漏出率远大于AST,此外ALT的血浆半衰期为47小时而AST仅为17小时，因此ALT反映肝细胞损伤的灵敏度较AST为高。但在严重肝细胞损伤时，线粒体膜亦损伤，可导致线粒体内AST的释放，血清中AST／ALT比值升高。 [参考值范围]比色法(Karmen)连续监测法(37℃)ALT5～25卡门氏单位10～40U/LAST8～28卡门氏单位10～40U/LALT／AST≤1 [临床意义](1)急性病毒性肝炎：ALT与AST均显著升高，可达正常的20～50倍，甚至100倍，ALT升高更明显，ALT／AST>1，是诊断病毒性肝炎重要检测手段。感染后1～2周，转氨酶达高峰，3周到5周逐渐下降。恢复期如转氨酶活性不能降至正常或再上升，提示转为慢性。急性重症肝炎初期转氨酶升高以AST明显，如在症状恶化时，黄疸进行性加深，酶活性反而降低，即出现“胆酶分离”，提示肝细胞严重坏死，顶后不佳。 (2)慢性病毒性肝炎：转氨酶轻度上升(100～200u)或正常，ALT／AST>1，若AST升高较ALT显著，即ALT／AST<1，提示慢性肝炎进入活动期。(3)酒精性肝病、药物性肝炎、脂肪肝、肝癌等非病毒性肝病，转氨酶轻度升高或正常，且ALT／AST<1。酒精性肝病AST显著升高，ALT几近正常，可能因为酒精具有线粒体毒性及与酒精抑制吡哆醛活性有关。· (4)肝硬化：转氨酶恬性取决于肝细胞坏死程度，终末期肝硬化转氨酶正常或降低。(5)胆汁淤积，转氨酶正常或轻度上升。(6)急性心肌梗塞后6～8小时，AST增高，18～24小时达高峰，可达正常上限的4～10倍，与心肌坏死范围和程度有关，4～5天后恢复。(7)其他疾病：如骨骼肌疾病、肺梗塞、肾梗塞、胰腺炎、休克及传染性单核细胞增多症，转氨酶轻度升高(50～200u)。 (二)碱性磷酸酶及其同工酶测定1．碱性磷酸酶(alkalinephoshatase,ALP)[原理]ALP主要分布在肝脏、骨骼、肾、小肠及胎盘中，血清中大部分ALP来源于肝脏和骨骼，因此常作为肝脏疾病的检查指标之一，胆道疾病时由于ALP生成增加而排泄减少，引起血清中ALP升高。 [参考值范围]磷酸对硝基苯酚连续监测法(30℃)：成人40～110U／L儿童<250U／L [临床意义](1)肝胆系统疾病：各种肝内、外胆管阻塞，如胰头癌、胆道结石引起的胆管阻塞、原发性胆汁性肝硬化、肝内胆汁淤积等，ALP明显升高，且与血清胆红素升高相平行，累及肝实质细胞的肝胆疾病(如肝炎、肝硬化)．ALP仅轻度升高。 (2)黄疸的鉴别诊断：ALP和血清胆红素、、转氨酶同时测定有助于黄疸鉴别诊断。①胆汁淤积性黄疸，ALP和血清胆红素明显升高，转氨酶仅轻度增加；②肝细胞性黄疸，血清胆红素中等度增加，转氨酶活性很高，ALP正常或稍高；③肝内局限性胆道阻塞(如原发性肝癌、转移性肝癌、肝脓肿等)，ALP明显增高，ALT无明显增高，血清胆红素大多正常。 (3)骨骼疾病：如纤维性骨炎、佝偻病、骨软化症、成骨细胞瘤及骨折愈合期、血清ALP升高。(4)生长中儿童、妊娠中晚期血清ALP生理性增加。 血清ALP增高常见原因 γ—谷氨酰转移酶：[原理]γ-谷氨酰转移酶(γ–glutamyltransferase，GGT)。GGT主要存在于细胞膜和微粒体上，参与谷胱苷肽的代谢。肾脏、肝脏和胰腺含量丰富，但血清中GGT主要来自肝胆系统。GGT在肝脏中广泛分布于肝细胞的毛细胆管一侧和整个胆管系统，因此当肝内合成亢进或胆汁排出受阻时，血清中GGT增高。（三)γ谷氨酰转移酶及同工酶测定 [参考值]硝基苯酚连续监测法(37。C)：<50U／L。 [临床意义](1)胆道阻塞性疾病：原发性胆汁性肝硬化、硬化性胆管炎等所致的慢性胆汁淤积，肝癌时由于肝内阻塞，诱使肝细胞产生多量GGT，同时癌细胞也合成GGT，均可使GGT明显升高，可达参考值上限的10倍以上。此时GGT、ALP、及血清胆红素呈平行增加。(2)急、慢性病毒性肝炎、肝硬化：急性肝炎时，GGT呈中等度升高，慢性肝炎、肝硬化非活动期，酶活性正常，若GGT持续升高，提示病变活动或病情恶化。 (3)急、慢性酒精性肝炎、药物性肝炎：GGT可呈明显或中度以上升高(300-1000U／L)，ALT和AST仅轻度增高，甚至正常。酗酒者当其戒酒后GGT可随之下降。(4)其他：脂肪肝、胰腺炎、胰腺肿瘤、前列腺肿瘤等GGT亦可轻度增加。 (五)单胺氧化酶测定[原理]单胺氧化酶(monoamineoxidase，MAO)为一种含铜的酶，分布在肝、肾、胰、心等器官，肝中MAO来自于线粒体，血清MAO活性与体内结缔组织增生呈正相关，因此临床上常用MAO活性测定来观察肝脏纤维化程度。MAO [参考值范围]成人正常值为：伊藤法<30单位中野法23--49单位 [临床意义]1．肝脏病变80％以上的重症肝硬化及肝癌患者MAO活性增高，但对早期肝硬化反应不敏感。急性肝炎时MAO正常，急性肝坏死时，血清中MAO增高。轻度慢性肝炎MAO大多正常，中、重度慢性肝炎有50％病人血清MAO增高。2．肝外疾病心力衰竭、糖尿病、甲状腺功能亢进症、系统硬化症等。MAO也可升高。 (六)脯氨酰羟化酶测定[原理]脯氨酰羟化酶(prolylhydroxylase，PH)是胶原纤维合成酶，能将胶原α-肽链上的脯氨酸羟化为羟脯氨酸。在脏器发生纤维化时，PH在该器官组织内的活性增加。当肝纤维化时，肝脏胶原纤维合成亢进，血清中PH增高，因此测定血中PH恬性可作为肝纤维化的指标。 [参考值范围]39.5±11．87μg／L [临床意义]1．肝脏纤维化的诊断肝硬化、原发性肝癌时PH活性明显增高。而转移性肝癌、急性肝炎、轻型慢性肝炎，PH大多正常，当肝细胞坏死加重伴胶原纤维合成亢进时，PH活性增加，慢性中、重度肝炎因伴有明显肝细胞坏死及假小叶形成，PH活性增高。2．肝脏病变随访及预后判断慢性肝炎、肝硬化患者，其PH活性进行性增高，提示肝细胞坏死及纤维化状态加重，若治疗后PH活性逐渐下降，提示治疗有效，疾病在康复过程中。 七、其他检查肝纤维化的肝功能检查包括单胺氧化酶、脯氨酰羟化酶，Ⅲ型前胶原N末端肽及透明质酸等的测定。血清铁常以铁蛋白形式贮存在肝、脾、骨黼中，当肝细胞发生变性坏死时，肝内贮存铁释放入血，血清铁含量升高。血清铜肝脏是人体组织中含铜量最大的器官，铜随胆汁进入肠道，肝内外胆汁淤积时，铜排泄受阻，血清铜和血浆铜蓝蛋白同时升高。 (一)Ⅲ型前胶原氨基末端肽测定[原理]慢性肝炎、肝硬化患者肝脏的结缔组织的生物合成增加，其主要成分是胶原。在胶原生成初期，首先生成前胶原，前胶原受到肽酶切割分离，成为Ⅲ型胶原和Ⅲ型前胶原氨基末端肽(aminoterminalprocollagentypeⅢpeptide，pⅢP)，部分进入血中。PⅢP常被用作肝脏纤维化的检测指标，多以放射免疫法加以检测。 [参考值范围]均值为100ng/L>150ng/L为异常 [临床意义]1．肝炎急性病毒性肝炎时血清PⅢP增高，但在炎症消退后PⅢP恢复正常，若PⅢP持续升高提示转为慢性活动性肝炎。因此PⅢP检测还可鉴别慢性持续性肝炎与慢性活动性肝炎。在酒精性肝炎时，PⅢP也明显增高，并与PH活性相关，此酶与胶原合成所必须的羟脯氨酸合成有关。 2．肝硬化血清PⅢP含量能可靠的反映肝纤维化程度和活动性，及肝脏的组织学改变，是诊断肝纤维化和早期肝硬化的良好指标。伴有肝硬化的原发性肝癌，血清PⅢP明显增高。但与原发性血色病患者的肝纤维化程度无相关性。3．用药监护及预后判断血清PⅢP检测可用于免疫抑制剂(如氨甲蝶呤)治疗慢性活动性肝炎的疗效监测，并可作为慢性肝炎的预后指标。 第三节肝脏病检查项目的选择与应用肝脏是人体重要器官之一，具有多种多样的物质代谢功能，由于肝脏功能复杂，再生和代偿能力很强，因此根据某一代谢功能所设计的检查方法，只能反映肝功能的一个侧面，而且往往须到肝脏损害到相当大的程度时才能反映出来，因而肝功能检查正常也不能排除肝脏病变。另外，当肝功能试验异常时，也要注意有无肝外影响因素。 目前尚无一种理想的肝功能检查方法能够完整的和特异的反映肝脏功能全貌。在临床工作中，临床医生必须具有科学的临床思维，合理选择肝脏功能检查项目，并从检验结果中正确判断肝脏功能状况，必要时可选择肝脏影像学、血清肝炎病毒标志物及肝癌标志物等检测技术，并结合患者临床的症状和体征，从而对肝脏功能做出正确而全面的评价。肝脏病检查项目选择原则如下： 1．健康检查选择ALT、肝炎病毒标志物、血清蛋白电泳及A／G比值测定。前两者可发现病毒性肝炎，后两者可发现慢性肝病。2．怀疑为无黄疸性肝炎时对急性患者可查ALT，前清蛋白、胆汁酸、尿内尿胆原及肝炎病毒标志物。对慢性患者加查AST、ALP、GGT、血清蛋白总量、A／G比值及血清蛋白电泳。 3．对黄疸患者的诊断与鉴别诊断时应查STB、CB，尿内尿胆原与胆红素、ALP、GGT、LP-X、胆汁酸。4．怀疑为原发性肝癌时除查一般肝功能(如ALT、AST、STB、CB)外，应加查AFP、GGT及其同工酶，ALP及其同工酶和LDH。5．怀疑为肝脏纤维化或肝硬化时ALT、AST、STB、A／G、蛋白电泳、ICGR为筛选检查，此外应查MAO、PH及PⅢP。 6．疗效判断及病情随访急性肝炎可查ALT、AST、前清蛋白、ICG、STB、CB；尿内尿胆原及胆红素。慢性肝病可观察ALT、AST、STB、CB、PT、血清总蛋白、A／G比值及蛋白电泳等，必要时查MAO、PH、PⅢP。原发性肝癌应随访AFP、GGT、ALP及其同工酶等。几种常见肝病肝功能改变见表4-5-3。 六种常见肝病的肝功能改变'