最新分子生物学技术新进展课件PPT.ppt 63页

'分子生物学技术新进展 二十一世纪医学发展的主要特点之一是对生命现象和疾病本质的认识逐渐向分子水平深入。最近十年，分子生物技术已成为医学领域极其有力的研究工具，基因工程技术、人类基因组计划与核酸序列测定技术、基因诊断与基因体外扩增技术、生物芯片技术、分子纳米技术在医学研究中和药物研制与开发中得到广泛应用，使得分子生物医学技术取得了突破性进展，也给医学带来了崭新的局面，分子生物技术已经成为现代医学的前沿和热点。 分子生物技术概述分子生物技术也称之为生物工程，是现代生物技术的主要标志，其内容包括基因工程技术、细胞工程技术、DNA测序技术、DNA芯片技术、酶工程技术等。重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一，也是基因工程(GeneEngineering)的核心技术。 以质粒为载体的DNA克隆过程 上述细胞的克隆系统可直接导入的目基因扩增，获得足够量的目的基因来进行结构与功能的研究。重组DNA技术的另一目的是获得基因重组后的产物——RNA，蛋白质。将目的基因与表达载体重组，导入宿主细胞进而表达出相应的基因产物（蛋白）。如胰岛素，干扰素；生产疫苗的抗原和特异的抗体等。重组DNA技术的目的 重组DNA和分子克隆的几种方法：（依目的基因的来源）1、从基因组中分离目的基因在细胞中克隆2、由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行克隆3、化学合成目的基因进行克隆4、PCR体外扩增目的片段进行克隆 PCR体系基本组成成分和步骤模板DNA特异性引物耐热DNA聚合酶dNTPsMg2+变性95˚C延伸72˚C退火Tm-5˚C 聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction）5Primer15Primer2Cycle2Cycle1555555TemplateDNA55555555 555555555555555525～30次循环后，模板DNA的含量可以扩大100万倍以上。Cycle3 二、PCR技术的主要用途（一）目的基因的克隆（二）基因突变利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。（三）DNA和RNA的微量分析PCR技术高度敏感，对模板DNA的量要求很低，是DNA和RNA微量分析的最好方法。 （四）DNA序列测定将PCR技术引入DNA序列测定，使测序工作大为简化，也提高了测序的速度；（五）基因突变分析PCR与其他技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。 三、几种重要的PCR衍生技术（一）逆转录PCR技术逆转录PCR(reversetranscriptionPCR，RT-PCR)是将RNA的逆转录反应和PCR反应联合应用的一种技术，是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。 原位PCR(insituPCR)是在组织切片或细胞涂片上的单个细胞内进行的PCR反应，然后用特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，再以放射自显影的方法显示结果。现在多用生物素酶免疫方法进行检测，可检出待测DNA或RNA是否在该组织或细胞中存在。（二）原位PCR技术 目前原位PCR发展最快的是荧光素标记的原位DNA杂交技术，即荧光原位杂交技术（fluorescenceinsituhybridization,简称FISH技术），是利用与荧光素分子偶联的单克隆抗体与抗原标记的探针分子特异性的结合来检测DNA序列在染色体上的位置。此技术在病理学诊断上有广泛的实用性，包括病毒感染的检测，特异性染色体的鉴别和肿瘤基因的检查等。 （三）实时定量PCR(real-timePCR)技术是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 分子杂交与印迹技术MolecularHybridizationandBlottingTechnique核酸分子杂交(nucleicacidhybridization)原理在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形成杂化双链(heteroduplex)。 复性RNADNA 目前已用于多种遗传性疾病的基因诊断，恶性肿瘤的基因分析，传染病病原体的检测等领域中，其成果大大促进了现代医学的进步和发展。 印迹技术（BlottingTechnique）原理利用各种物理方法使电泳胶中的生物大分子转移到NC等各种膜上，使之成为固相化分子。这一技术类似于用吸墨纸吸收纸张上的墨迹，因此称之为“blotting”，译为印迹技术。 （一）DNA印迹(SouthernBlotting)（二）RNA印迹(NorthernBlotting)（三）蛋白质的印迹(WesternBlotting)用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的分析。用于RNA的定性定量分析。用于蛋白质定性定量及相互作用研究。 其他：斑点印迹(dotblotting)原位杂交(insituhybridization)DNA点阵(DNAarray)DNA芯片技术(DNAchip) 生物芯片技术BiologicalChipTechnique基因芯片(genechip)是集成化的核酸分子杂交技术，将许多特定的DNA片段有规律地紧密排列固定于单位面积的支持物上，然后与待测的荧光标记样品进行杂交，再用荧光检测系统对芯片进行扫描，通过计算机系统对每一位点的荧光信号做出检测、比较和分析。该技术亦被称作DNA微阵列(DNAmicroarray)。 蛋白质芯片(proteinchip)是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。 分子生物学技术在临床上的应用基因诊断和基因治疗 一、基因诊断(GeneDiagnosis)利用分子生物学及分子遗传的技术和原理，在DNA水平分析、鉴定遗传疾病所涉及基因的置换、缺失或插入等突变。1.DNA序列分析用于基因突变类型已经明确的遗传病的诊断及产前诊断，例如血友病、囊性纤维变性、杭延顿氏舞蹈症、抗胰酶缺乏症等均可检测。 2.PCR技术快速检出样品中的痕量病原微生物，例如乙型病毒性肝炎、丙型病毒性肝炎，爱滋病等。微量DNA样品中的基因及基因变异分析。用于个体识别、亲缘关系鉴定、器官移植术前组织配型、基因连锁分析等等。应用PCR技术检测孕妇血液判别胎儿性别获得成功的报道。 3.基因芯片(genechip)样品中痕量病原微生物的迅速检出、分类及分型。同时分析样品中可能存在的多种不同基因变异方式。分析样品中耐药菌株的存在和个体对药物或毒物的敏感性。分析个体的疾病易感状态，如肿瘤、自身免疫病发生的预警。 基本原理:向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。基因治疗的基本策略缺陷基因精确的原位修复及基因增补基因失活基因疫苗二、基因治疗(GeneTherapy)基因矫正基因置换 纳米技术能使DNA通过主动靶向作用定位于缺陷的细胞。如果将质粒DNA缩小到50～200nm，带上负电荷进入到细胞核，插入到细胞核DNA的确切部位，就能起到对症治疗的效果，使临床诊断和治疗过程效率得以提高。 由于现代纳米技术的发展，无机纳米颗粒体积很小，可在血管中随血液循环，透过血管壁进入各个脏器的细胞中，作为新型非病毒型基因载体能有效介导DNA的转导，并使其在细胞内高水平的表达，从而为基因表达、功能研究及基因治疗提供了新的技术和手段 谢谢！再见！ 惠州市第三人民医院神经内科黄志勇短暂性脑缺血发作的诊断与治疗 因脑血管病变引起的短暂性、局限性脑功能缺失或视网膜功能障碍临床症状一般不超过1小时内缓解，最长不超过24小时不遗留神经功能缺损症状结构性影像学(CT、MRI)检查无责任病灶凡临床症状持续超过1小时且神经影像学检查有明确病灶者不宜称为TIA概述 TIA的发病与动脉粥样硬化、动脉狭窄、心脏病、血液成分改变及血流动力学变化等多种病因及多种途径有关主要的发病机制有:血流动力学说微栓子学说病因及发病机制 各种原因(如动脉硬化和动脉炎等)所致的颈内动脉系统或椎-基底动脉系统的动脉严重狭窄—血压的急剧波动导致原来靠侧枝循环维持的脑区发生一过性缺血此型TIA的临床症状比较刻板，发作频度较高，每天或每周可有数次发作，每次发作持续时间多不超过10min1.血液动力学说病因及发病机制 微栓子主要来源动脉粥样硬化的不稳定斑块附壁血栓的破碎脱落瓣膜性或非瓣膜性心源性栓子及胆固醇结晶2.微栓子学说病因及发病机制 微栓子阻塞小动脉常导致其供血区域脑组织缺血，当栓子破碎或溶解移向远端时，血流恢复，症状缓解此型TIA的临床症状多变，发作频度不高，数周或数月发作一次，每次发作持续时间较长，可达数十分钟至2小时病因及发病机制 一般特点TIA好发于中老年人，男性多于女性，多伴高血压、动脉粥样硬化、糖尿病或高血脂等脑血管病危险因素发病突然，历时短暂，最长时间不超过24小时局灶性脑或视网膜功能障碍；恢复完全，不留后遗症状；反复发作，每次发作表现基本相似临床表现 缺血对侧肢体的单瘫、轻偏瘫、面瘫和舌瘫可伴有偏身感觉障碍和对侧同向偏盲优势半球受损常出现失语和失用非优势半球受损可出现空间定向障碍1.颈内动脉系统TIA(1)大脑中动脉(MCA)供血区的TIA临床表现 (2)大脑前动脉(ACA)供血区TIA(3)颈内动脉(ICA)主干TIA人格和情感障碍、对侧下肢无力眼动脉交叉瘫Horner交叉瘫临床表现 (2)可有单侧或双侧面部、口周麻木，或伴有对侧肢体瘫痪、感觉障碍，呈现典型或不典型的脑干缺血综合征2.椎-基底动脉系统TIA(1)眩晕、平衡障碍、眼球运动异常和复视临床表现 ①跌倒发作(dropattack)患者转头或仰头时，下肢突然失去张力而跌倒，无意识丧失，常可很快自行站起系下部脑干网状结构缺血所致(3)特殊表现的临床综合征：临床表现 ②短暂性全面性遗忘症(TGA)发作时出现短时间记忆丧失，病人对此有自知力，持续数分至数十分钟发作时对时间、地点定向障碍，但谈话、书写和计算能力正常大脑后动脉颞支缺血累及边缘系统的颞叶海马、海马旁回和穹隆所致临床表现 ③双眼视力障碍发作双侧大脑后动脉距状支缺血导致枕叶视皮层受累，引起暂时性皮质盲临床表现 CT或MRI检查大多正常，部分病例(发作时间＞60min者)于弥散加权MRI可见片状缺血灶CTA、MRA及DSA可见血管狭窄、动脉粥样硬化斑TCD可发现颅内动脉狭窄，并可进行血流状况评估和微栓子监测血常规和生化检查是必要的神经心理学检查可能发现轻微的脑功能损害辅助检查 大多数TIA患者就诊时临床症状已消失，诊断主要依靠病史中老年患者突然出现局灶性脑功能损害症状，符合颈动脉或椎-基底动脉系统及其分支缺血表现，并在短时间内症状完全恢复(多不超过1小时)，应高度怀疑为TIAPWI/DWI、CTP和SPECT有助TIA的诊断1.TIA的诊断诊断及鉴别诊断 特别是单纯部分发作，常表现为持续数秒至数分钟的肢体抽搐或麻木针刺感，从躯体的一处开始，并向周围扩展可有脑电图异常CT/MRI检查可能发现脑内局灶性病变2.TIA的鉴别诊断癫痫的部分性发作诊断及鉴别诊断 发作性眩晕、恶心、呕吐与椎-基底动脉TIA相似，但每次发作持续时间往往超过24小时伴有耳鸣、耳阻塞感，反复发作后听力减退等症状除眼球震颤外，无其他神经系统定位体征。发病年龄多在50岁以下梅尼埃病(Ménieredisease)2.TIA的鉴别诊断诊断及鉴别诊断 严重心律失常如室上性心动过速、多源性室性早搏、室速或室颤、病态窦房结综合征等可因阵发性全脑供血不足，出现头昏、晕倒和意识丧失，但常无神经系统局灶性症状和体征动态心电图监测、超声心动图检查常有异常发现阿-斯综合征(Adams-Strokessyndrome)2.TIA的鉴别诊断诊断及鉴别诊断 颅内肿瘤、脓肿、慢性硬膜下血肿、脑内寄生虫等亦可出现类似TIA发作症状原发或继发性自主神经功能不全亦可因血压或心律的急剧变化出现短暂性全脑供血不足，出现发作性意识障碍基底动脉型偏头痛，常有后循环缺血发作，应注意排除2.TIA的鉴别诊断其他诊断及鉴别诊断 常用的TIA危险分层工具为ABCD2评分症状发作在72小时内并存在以下情况之一者，建议入院治疗：①ABCD2评分>3分②ABCD2评分0～2分，但TIA系统检查门诊不能在2天之内完成③ABCD2评分0～2分，并有其他证据提示症状由局部缺血造成，如DWI已显示对应小片状缺血灶TIA是急症TIA发病后2～7天内为卒中的高风险期，对患者进行紧急评估与干预可以减少卒中的发生1.TIA短期卒中风险评估治疗 TIA的ABCD2评分TIA的临床特征得分年龄（A）＞60岁1血压（B）收缩压＞140或舒张压＞90mmHg1临床症状（C）单侧无力2不伴无力的言语障碍1症状持续时间（D）＞60分钟210~59分钟1糖尿病（D）有1治疗 抗血小板聚集剂：非心源性栓塞性TIA推荐抗血小板治疗①阿司匹林75~150mg/d，餐后服用②氯吡格雷75mg/d，PO③小剂量阿司匹林和缓释的双嘧达莫（分别为25mg和200mg，2次/d）2.药物治疗治疗 抗凝药物：心源性栓塞性TIA可采用抗凝治疗主要包括肝素、低分子肝素和华法令①卒中高度风险的TIA患者应选用半衰期较短和较易中和抗凝强度的肝素②频繁发作的TIA或椎-基底动脉系统TIA患者，对抗血小板聚集剂治疗无效的病例可考虑抗凝治疗治疗 ③对瓣膜置换术后已服用足量口服抗凝剂治疗的TIA患者也可加用小剂量阿司匹林或双嘧达莫联合治疗在口服抗凝剂等期间，应动态监测凝血功能，根据结果调整用药量！一般在短期使用肝素后改为华法林口服抗凝剂治疗，华法林治疗目标为国际标准化比值（internationalnormalizedratio，INR）达到2～3，用药量根据结果调整。治疗 扩容治疗：纠正低灌注，适用于血流动力型TIA溶栓治疗：对于新近发生的符合传统TIA定义的患者，虽神经影像学检查发现有明确的脑梗死责任病灶，但目前不作为溶栓治疗的禁忌证。在临床症状再次发作时，若临床已明确诊断为脑梗死，不应等待，应按照卒中指南积极进行溶栓治疗治疗 其他①高纤维蛋白原血症的TIA患者，可选用降纤酶治疗②老年TIA并有抗血小板聚集剂禁忌症或抵抗性者可选用活血化瘀性中药制剂治疗治疗 3.TIA的外科治疗治疗颈动脉或椎-基底动脉严重狭窄(>70％)的TIA患者，经抗血小板聚集治疗和/或抗凝治疗效果不佳或病情有恶化趋势者，可酌情选择血管内介入治疗、动脉内膜切除术或动脉搭桥术治疗 未经治疗或治疗无效的病例，部分发展为脑梗死，部分继续发作，部分可自行缓解预后 Thanks'