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'05版微生物限度检查法课件 中国药典2005版微生物限度检查法在检查项目、格式、语言表述等方面都有较多的增定和修订。增订中主要的有四项：一是三菌数测定的方法验证；二是控制菌检查的方法验证；三是大肠菌群检查法；四是梭菌检查法。 前言●微生物限度检查在环境的洁净度10000级和局部100级的单向流空气区域内进行，其全过程应严格遵守无菌操作，以防再污染。单向流空气区域、工作台面及环境必须定期按国家《医药工业洁净室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌测试方法》现行标准进行洁净度验证。隔离系统按相关的要求进行验证，其内部环境的洁净度须符合无菌检查的要求。 非水溶性供试品①供试品5g，司盘80、单硬脂酸甘油酯、聚山梨酯80●②供试品10g，20ml无菌十四烷酸异丙酯和无菌玻璃珠，必要时再加适量十四烷酸异丙酯，充分振摇，使供试品溶解。然后加45℃100mlpH7.0蛋白胨氯化钠缓冲液，振摇5-10分钟，萃取，待油水分层后，水层过滤，贴膜培养。7类供试品供试液的制备，其中增订： ●非水溶性膜剂供试品化学药膜剂取100cm2，剪碎，加100mlpH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，浸泡，振摇，作供试液。一部中药膜剂取50cm2，剪碎，适量的pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲溶液（50或100ml）浸泡，振摇，以供试品浸液为供试液。（SOP2000版规定:中药膜剂取30~50cm2，剪碎，加水100ml）。●肠溶及结肠溶制剂供试品10g，加100mlpH6.8无菌磷酸盐缓冲液（肠溶制剂）或pH7.6无菌磷酸盐缓冲液（结肠制剂）,于45℃水浴振摇，使溶解。 ●气雾剂、喷雾剂供试品取规定量供试品，置冷冻室冷冻1h，取出，迅速消毒供试品开启部位周围，用无菌钢锥钻一小孔，放置室温并轻轻转动容器，使抛射剂全部抛出。以无菌注射器吸出全部药液，按标示量加稀释剂至足量（若含非水溶性成份，加适量无菌聚山梨酯-80液），使均匀，取相当于10g或10ml的供试品，再稀释成1∶10的供试液。 具抑菌活性的供试品当供试品具有抑菌活性时，应将供试液中的抑菌活性消除后，方能依法检查。常用的方法有：①培养基稀释法取规定量的供试液，至较大量的培养基中，使单位体积内的供试品含量减少至不具抑菌作用。测定细菌、霉菌及酵母菌的菌数时，取同稀释级2ml供试液等量分注多个平皿，按浇碟法操作，培养、计数。每1ml供试液所注各平皿生长的菌数之和即为1ml的菌落数，取平均菌落数乘以稀释倍数的值按菌数报告规则报告菌数。控制菌检查时，可加大增菌培养基的用量。 ②离心沉淀集菌法取规定量的供试液，3000转/分离心20min（供试液如有沉淀，先以500转/分离心5min，取全部上清液再离心），弃去上清液，留底部集菌液约2ml，加稀释剂至原规定量。③薄膜过滤法采用开放式薄膜过滤器。④中和法凡含汞、砷或防腐剂等具有抑菌作用的供试品，可用适宜的中和剂或灭活剂消除其抑菌成分。中和剂或灭活剂可加在所用的稀释剂或培养基中。 对药品进行微生物限度检查法时，首先应进行检测方法的验证。如细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证，以确认该计数方法是否科学、准确、客观。若供试品的组分或原检验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证。验证时，按供试液的制备，细菌、霉菌和酵母菌计数所规定的方法及下列要求进行。对各试验菌的回收率应逐一进行验证。细菌、霉菌及酵母菌计数增订计数方法的验证 菌株大肠埃希菌CMCC（B）44102、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、枯草芽孢杆菌、CMCC（B）63501白色念株菌CMCC(F)98001、黑曲霉菌CMCC(F)98003。菌液制备大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌接种营养肉汤，白色念株菌接种真菌培养基、黑曲霉接种真菌培养基斜面，置规定温度、时间，培养。取培养物用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成1ml含50~100cfu的菌液。验证用菌株及菌液的制备 试验组取规定量最低稀释级的供试液1ml，和50~100cfu试验菌，每株菌做2个平板，按平板菌落计数方法测定其菌数。采用薄膜过滤法计数时，最后一次冲洗液中加入50-100cfu，过滤，培养，计数。菌液组测定加入的试验菌液的菌数。供试品对照组取规定量的供试液，按平板法测定供试品稀释液本底的菌数。稀释剂对照组取稀释液，加入试验菌，使菌浓度为每1ml供试液含50~100cfu，按试验组的供试液制备方法和菌落计数方法测定其菌数。验证试验应独立平行进行3次，分别计算各次试验菌的回收率。验证方法 试验组的菌回收率=[（试验组平均菌落数–供试品对照组平均菌落数）/菌液组平均菌落数]×100%稀释剂对照组的菌回收率=[（稀释剂对照组的平均菌落数/菌液组的平均菌落数）]×100% 结果判断在三次平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率应大于70%。若试验组的菌回收率均大于70%，符合验证试验，可按此方法测定细菌、霉菌和酵母菌数；若任一次平行试验中试验组的菌回收率均小于70%，不符号验证试验，应采用培养基稀释法、离心集菌法、过滤法、中和法等方法或这些方法联合使用消除供试品抑菌活性，并重新验证。验证试验可与供试品的细菌、霉菌及酵母菌计数同时进行。 2.检查法（1）平皿法增订阴性对照试验取试验用的稀释剂1ml，于无菌平皿中，注培养基，凝固，培养。每种计数培养基各做2个平板，均不得长菌。修订细菌、霉菌和酵母菌计数的培养时间。细菌一般48h，真菌72h；必要时，可适当延长培养时间5-7d。（细菌培养时间USP48-72h，Ep5d；真菌培养时间USP5-7d，EP5d。平皿法；平皿法和涂抹法） 在特殊情况下，营养琼脂培养基上长霉菌、酵母菌或玫瑰红钠琼脂培养基上长细菌，则应分别点计霉菌、酵母菌、细菌菌落数，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果报告。 细菌数30~300，霉菌数30~100。①当仅有1个稀释级的菌落数符合上述规定，以该级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。菌数报告规则 当同时有2个稀释级的菌落数符合上述规定时，视两者比值（比值为高稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值除以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值）而定。若比值不大于2，以两稀释级的菌落数乘以稀释倍数的均值报告菌数；若比值大于2但不超过5时，以低稀释级的菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。当出现比值大于5，或高稀释级的菌落数大于或等于低稀释级的菌落数等异常情况时，应查明原因再行检查，必要时，应进行方法的重新验证。 ③当各稀释级的平均菌落数均小于30，以最低稀释级的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告菌数。④各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以＜1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。 （2）薄膜过滤法。取相当于1g或1ml供试品的供试液，加至100ml稀释剂中，混匀，过滤。用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液或其它适宜的冲洗液冲洗滤膜，冲洗方法和冲洗量同“方法的验证”。冲洗后取出滤膜，菌面朝上贴于营养琼脂培养基或玫瑰红钠琼脂培养基或酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基平板上培养。每种培养基至少制备一张滤膜。 阴性对照试验取试验用的稀释剂2ml同法操作，作为阴性对照。阴性对照不得有菌生长。目的：检验稀释剂或冲洗液、吸管、滤器、培养基、环境和操作技术是否符合无菌性要求。培养和计数培养条件和计数方法同平皿法，每片滤膜上的菌落数应不多于100个。菌数报告规则以相当于1g或1ml供试品的菌落数报告菌数；若最低稀释级的滤膜上无菌落生长，以＜1报告菌数（1g或1ml供试品/滤膜），或1＜乘以稀释倍数的值报告菌数。 控制菌检查1.方法的验证对供试品进行控制菌检查时，应对检查法的科学、准确性进行验证，以确认所采用的方法是否适合该药品的控制菌检查。若药品的组分或原法的检验条件有改变可能影响检验结果的准确性，检查法应重新验证。验证时按各品种项下微生物限度规定控制菌选择相应菌株验证，验证大肠菌群检查法时，应用大肠埃希菌作为验证菌株。验证试验按供试液的制备和控制菌检查法的规定及下列要求进行。 菌株大肠埃希菌CMCC（B）44102、金黄色葡萄球菌CMCC（B）26003、乙型副伤寒沙门菌CMCC（B）50094、铜绿假单胞菌CMCC（B）10104、生孢梭菌CMCC（B）64941。菌液制备将大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌的新鲜培养物接种营养肉汤、生孢梭菌新鲜培养物接种硫乙醇酸盐流体培养基，培养18~24h，取培养物1ml用0.9%无菌氯化钠溶液稀释至1ml含10~100cfu。验证方法①试验组：取规定量供试液及10～100cfu试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取供试液，过滤、冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，取出滤膜接入增菌培养基中。 ②阴性菌对照组：设立阴性菌对照组是为了验证该控制菌检查方法的特异性。方法同试验组，验证大肠埃希菌、大肠菌群、沙门菌检查法时的阴性对照菌采用金黄色葡萄球菌；验证铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌检查法时的阴性对照菌采用大肠埃希菌。阴性对照菌不得检出。结果判定阴性菌对照组不得检出阴性对照菌。若试验组检出试验菌，按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查；试验组未检出试验菌，应采用稀释法、离心沉淀集菌法、薄膜过滤法、中和法等方法或联合使用这些方法消除供试品的抑菌活性，并重新验证。验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。 2.检查法供试品的控制菌应按已验证的方法进行控制菌检查，增菌培养基的实际用量同“方法的验证”。阳性对照试验供试品进行控制菌检查时，应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10～100cfu，方法同供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。阴性对照试验取稀释剂10ml加入100ml（或200ml）相应控制菌检查用的增菌培养基中，培养，应无菌生长。 控制菌检查的步骤：取供试液接种增菌培养基，增菌、分离培养，革兰染色、生化试验等基本未变动，仅一些控制菌保留了前几项主要生化鉴别试验，删去了一些生化鉴别方法，这样的删节、简写，主要是节省篇幅。并不是删去，可以不做。如有可疑菌落，应进行分离、纯化、革兰染色镜检和适宜的生化试验，确认是否是要检查的控制菌。 大肠埃希菌取供试液10ml直接或处理后接种至100ml的胆盐乳糖培养基中，培养18～24小时，必要时可延至48小时。取上述培养物0.2ml，接种至含5mlMUG培养基的试管内，培养，于5、24小时在366nm紫外光下观察，同时用未接种的MUG培养基作本底对照。若管内培养物呈现荧光，为MUG阳性；不呈现荧光，为MUG阴性。观察后，沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液，液面呈玫瑰红色，为靛基质阳性；呈试剂本色，为靛基质阴性。本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性。 如MUG阳性、靛基质阳性，判供试品检出大肠埃希菌；如MUG阴性、靛基质阴性，判供试品未检出大肠埃希菌；如MUG阳性、靛基质阴性，或MUG阴性、靛基质阳性，则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养18～24小时。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1所列的菌落形态特征不符，判供试品未检出大肠埃希菌。若平板上生长的菌落与表1所列的菌落形态特征相符或疑似，应进行分离、纯化、染色镜检和适宜的生化试验，确认是否为大肠埃希菌。（ChP、BP、USP） 大肠菌群菌落形态特征菌落疑似者再进行确证试验菌落接种到胆盐乳糖发酵管，产酸产气报告检出大肠菌群，否则判未检出培养基菌落形态曙红亚甲蓝琼脂呈紫黑色、紫红色、红色或者粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润。麦康凯琼脂呈鲜桃红色或者粉红色，圆形，扁平或稍凸起，边缘整齐，表面光滑，湿润。 大肠埃希菌在EMB、MAC上的特征 生化试验 沙门菌修订取供试品10g或10ml加至200ml的营养肉汤培养基中，用匀浆仪或其他适宜方法混匀，为试验组。取10ml稀释液加至200ml营养肉汤培养基中，为阴性对照组。培养18~24h，阴性对照应无菌生长。取上述培养物1ml，接种四硫磺酸钠亮绿培养基，培养后，划线分离胆盐硫乳琼脂（或SS）或MacC(或EMB)培养基平板，培养18～24h（必要时延长至40～48h）。若平板上无菌落生长，或生长的菌落不同于表中所列的特征，判供试品未检出沙门菌。 若平板上生长的菌落特征与表中所列的菌落形态特征相符或疑似，用接种针挑选2～3个菌落分别于三糖铁琼脂培养基高层斜面上进行斜面和高层穿刺接种培养18～24小时，如斜面未见红色、底层未见黄色或斜面黄色、底层无黑色，判供试品未检出沙门菌否则，应取三糖铁琼脂培养基斜面的培养物进行适宜的生化试验和血清凝集试验，确认是否为沙门菌。（ChP、BP、USP） 增菌培养预增菌取营养肉汤培养基3瓶，每瓶各100ml，2瓶加入1：10供试液各10ml，其中1瓶加入对照菌液0.1ml(含菌量为50～100个cfu/ml)作阳性对照，第3瓶加入稀释剂10ml作阴性对照，培养18～24h后观察。摇动阴性对照瓶后应清亮透明，无菌生长，否则试验无效增菌培养轻微摇动供试品增菌培养瓶及阳性对照培养瓶，分别吸取1ml各接种于1管四硫磺酸钠亮绿培养基中，培养18～24h。阳性对照管应呈现混浊 分离培养轻微摇动供试品增菌培养瓶和阳性对照增菌培养瓶，以接种环分别沾取1～2环培养液接种于胆盐硫乳琼脂(DHL)或沙门菌志贺菌琼脂(SS)平板及曙红亚甲蓝(EMB)琼脂或麦康凯琼脂平板各1个，倒置培养24～48h。检查平板上有无疑似沙门菌菌落 沙门菌在分离平板上的菌落形态特征见表平板沙门菌属亚属ⅠⅡⅣⅤ沙门菌亚属Ⅲ胆盐硫乳琼脂(DHL)无色或微带橙色，透明或半透明，边缘整齐、光滑、中等大小或较小，产H2S的菌落中心或几乎全黑色发酵乳糖的菌株菌落为粉红色，中心带黑色，迟缓发酵乳糖或不发酵乳糖的菌株菌落与亚属ⅠⅡⅣⅤ同沙门菌属志贺菌属琼脂(S.S)无色或微带粉色，透明或半透明，边缘整齐、光滑，中等大小或较小，产H2S的菌落，中心呈黑色。同一平板上常有多数菌落无黑色中心同胆盐硫乳琼脂平板。但发酵乳糖无黑色中心的菌落与大肠埃希菌不能区别曙红亚甲蓝琼脂(EMB)无色或微带橙色，透明或半透明，中等大小，边缘整齐光滑发酵乳糖的菌株菌落为紫色。迟缓发酵乳糖或不发酵乳糖的菌株与沙门菌亚属ⅠⅡⅣⅤ同麦康凯琼脂(MacC)同曙红亚甲蓝琼脂平板发酵乳糖的菌株菌落为粉红色，不发酵乳糖或迟缓发酵乳糖的菌株与沙门菌亚属ⅠⅡⅣⅤ同 菌落特征补充由于沙门菌不发酵乳糖和蔗糖，不产酸，菌落不着色，一般为无色半透明，多数沙门菌因产生H2S，菌落中心呈现黑色甚至全黑色，在DHL琼脂平板上较为明显在SS琼脂平板上，H2S特征有时不明显，沙门菌属亚属Ⅲ因多数菌株发酵乳糖，故在上述平板上的乳糖发酵菌落呈现粉红或紫色，但由于产生H2S，在有H2S指示系统的平板上仍出现黑色中心在上述培养基上，有些非沙门菌属细菌，也可呈现类似沙门菌菌落形态，须进一步鉴别阳性对照平板上，应有沙门菌落形态特征的菌落生长，否则，应查明原因。若为供试品抑菌成分所致，须重新制备供试液，消除抑菌成分影响后再行检查由于药物的影响或非典型菌株的存在，沙门菌菌落可呈现非典型形态，如色泽变深，菌落粗糙等，应注意辨别 菌落与结果报告如阳性对照平板有典型菌落生长，供试品平板均未生长或无疑似菌落生长，则报告1g或1ml供试品未检出沙门菌 菌落传纯从每个供试品的分离平板上挑取2～3个疑似菌落(无色或微带橙色，产H2S的菌落；无色或微带橙色、不产H2S的菌落；红色，产H2S的菌落)分别接种于三糖铁琼脂斜面，接种时应以接种针轻轻接触单个菌落中心部位，沾取培养物划线于三糖铁琼脂斜面（或者克氏双糖铁琼脂斜面，制备可以查阅相关工具书）并穿刺到底层或先穿刺底层再划线斜面，培养24±2h，观察结果 三糖铁琼脂反应疑似沙门菌在三糖铁琼脂斜面上的反应①斜面红色(产碱)，底层黑色(产H2S)并显示黄色(产酸)；②斜面红色，底层黄色；③斜面黄色，底层黑色，并显示黄色。多数沙门菌在三糖铁琼脂上产生气体，使底层琼脂出现气泡或使琼脂断裂，但也有不产生气体的菌种。对在三糖铁琼脂斜面黄色并同时底层无黑色，或斜面及底层均为红色者可以排除沙门菌。 脲酶试验用接种环沾取少许培养物，划线接种于脲琼脂斜面，培养4及24h，观察结果。红色为阳性反应，沙门菌属为阴性反应，与变形杆菌相区别 赖氨酸脱羧酶试验用接种环沾取少许培养物，接种在赖氨酸脱羧酶培养基中，同时接种一支不含赖氨酸的同样培养基作为对照管，培养24～48h观察结果。对照管黄色(产酸)，试验管呈紫色为阳性反应(赖氨酸脱羧产碱)；试验管黄色为阴性反应。沙门菌应为阳性反应 动力试验用接种针沾取培养物，穿刺接种于半固体营养琼脂管中，培养24h，观察结果。有动力的细菌能在穿刺线以外的培养基内扩散生长使培养基呈混浊现象；无动力的细菌仅能沿穿刺线生长，不向外扩散，培养基仍呈清晰透明状；无动力表现的培养物，应在室温保留2～3天后，再行观察。沙门菌除鸡雏沙门菌及无动力的变种外，均具有周身鞭毛，能运动 靛基质试验用接种环沾取少许培养物，接种到蛋白胨水培养基中，照大肠杆菌检查法靛基质试验项下操作、判断结果。沙门菌应为阴性反应 血清学凝集试验 凝集反应的观察将玻片前后倾斜数次，以暗色背景衬底，在良好的照明条件下进行观察，任何程度的凝集现象都是阳性反应。阳性反应通常在3min内发生。有时因血清效价低、反应迟缓时，应将玻片置培养皿内，并放一个湿棉球在旁边，盖上皿盖，经约20min，再观察结果 凝集试验的结果判定如试验及对照试验均出现凝集现象为非特异反应，须对该菌株培养物进行处理后再作凝集试验当培养物与0多价1血清未出现凝集现象时，应以接种环取上述斜面培养物，置于含少量0.9%无菌氯化钠溶液的试管中，制成浓菌悬液，在100℃水浴中保温30min，以除去可能存在的Vi抗原，待冷后再以此处理后的菌悬液与沙门菌0多价1血清按上法作凝集试验。如出现凝集，仍判为阳性反应；如不出现凝集现象，则为阴性反应 铜绿假单胞菌胆盐乳糖培养基增菌，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，培养18～24h。特征性菌落，纯培养，革兰染色，镜检及氧化酶试验，绿脓菌素试验。若疑似菌为革兰阴性杆菌，氧化酶试验阴性，判供试品未检出铜绿假单胞菌。否则，应进行绿脓菌素试。若氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阳性，判供试品检出铜绿假单胞菌。若上述疑似菌为革兰阴性杆菌、氧化酶试验阳性及绿脓菌素试验阴性，应继续进行适宜的生化试验，确认是否为铜绿假单胞菌。 金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)取亚碲酸钠肉汤（或营养肉汤）培养基培养18~24h，必要时可延至48h的培养物，划线接种于卵黄氯化钠琼脂培养基或甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，培养24～72h。若平板上无菌落生长或生长的菌落不同于表5所列特征，判供试品未检出金黄色葡萄球菌。若平板上生长的菌落与表5所列的菌落特征相符或疑似，应挑选2～3个菌落，分别接种于营养琼脂培养基斜面上，培养18～24h。取营养琼脂培养基的培养物进行革兰染色，并接种于营养肉汤培养基中，培养18～24h，作血浆凝固酶试验。 增订大肠菌群和梭菌检查法。大肠菌群（Coliform或Coliformbacteria）作为水质粪便污染的指示菌已有80多年的历史。大肠菌群是指在37℃生长时能发酵乳糖，24h内产酸产气的革兰阴性无芽孢杆菌。符合上述定义的细菌除大肠埃希菌属外，还包括肠杆菌科的肠杆菌属、枸橼酸菌属、克雷伯菌属。大肠菌群基本上包括了正常人畜肠道内的全部需氧的革兰阴性杆菌，较大肠埃希菌更具代表性，且存活时间较长。故检出大肠埃希菌，一般认为药品受粪便的近期污染；而检出大肠菌群，则表示药品受粪便的近期或远期污染。以大肠菌群作为口服药品微生物限度标准的控制菌，具有广泛的卫生学意义，更能反映药品的卫生质量 大肠埃希菌属枸橼酸菌属克雷伯菌属肠杆菌属ⅠⅡⅢⅣⅠⅡⅠⅡⅢⅣⅠⅡI+-+--+-+---+M++++++------V-P------++++++C----++++-+++H2S------------乳糖（44℃）+--+-----+--大肠菌群分类 1.肠杆菌中能迅速发酵乳糖产气的4类细菌，只有大肠埃希菌才能代表人和动物粪便的污染。样本中捡出大肠菌群时，还得确认是否是大肠埃希菌。直接检查E.coli，一步到位。64年我国食品卫生亦采用检查大肠埃希菌，一步到位。但多数采取检查大肠菌群，然后确定是否是粪便来源，二步到位。2.检查大肠菌群乳糖发酵的4类菌，其卫生学意义是相同的，都是来自人和动物的粪便污染，检查大肠菌群即可。WHO50年来一贯的方法，在大多数国家推行。为了与国际接轨，我国74年开始采用国际通用的大肠菌群检查法。3.只要是发酵型的细菌，便可认为是大肠菌群。采用葡萄糖发酵试验检测，包括了肠杆菌科所有的细菌。前苏联20世纪50年代引入我国，一直沿用到20世纪60年代初期。 大肠菌群检查方法1.食品卫生国标方法初发酵，3管或5管胆盐乳糖培养基，产酸产气；EMB分离培养，挑选多个可疑菌落，复发酵确证，报告MPN。2.WHO假定试验，MacC肉汤或乳糖胰胨肉汤，产气，假定阳性；不产气，再培养24h，产气，假定阳性假定阴性；不产气，假定阴性。证实试验阳性管接种煌绿乳糖胆盐肉汤2管，1管37℃48h，产气，报告检出大肠菌群。1管44℃24h，产气，报告检出耐热大肠菌群 大肠菌群的检查方法是成熟的，在食品大肠菌群检查中已广泛使用。但药品不同于食品，有些药品有抑菌作用，因此在药品中检查大肠菌群，必须采用适当的方法对供试品进行处理，消除其抑菌作用后方可检查。同时从方法学的可信度考虑，应设阳性对照和阴性对照。因此，推荐的大肠菌群检查法是经过大量考察验证、准确可靠、简便易行的方法。初步考察结果表明，大肠菌群的检出率远高于大肠埃希菌，粪大肠菌群的检出率为零。不难看出，以大肠菌群作为口服药品的控制菌较为合理，更具实际意义。 取乳糖胆盐发酵管3支，分别加入1：10供试液1ml(供试品量0.1g或0.1ml)，1：100供试液1ml(供试品0.01g或0.01ml)，1：1000供试液1ml(供试品0.001g或0.001ml)。另取1支乳糖胆盐发酵管，加1ml稀释剂，作阴性对照。各管置36±1℃培养18~24h，阴性对照应无菌生长。 乳糖胆盐发酵管若无菌生长，或有菌生长但不产酸产气（或产酸不产气），报告供试品未检出大肠菌群；如有产酸产气者，应将产酸产气的发酵管分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板上，培养18～24h，。如平板上无菌落生长，或有菌落生长但不发酵乳糖、非革兰阴性无芽孢杆菌的菌落，判该管未检出大肠菌群；如平板上生长的菌落与表3所列的菌落形态特征相符或疑似，为革兰阴性无芽孢杆菌的菌落，应做确证试验。 确证试验取上述平板上的可疑菌落4～5个，各接种1支乳糖发酵管，培养24～48h。凡产酸产气、革兰阴性无芽孢杆菌判该管检出大肠菌群。反之，判该管未检出大肠菌群。根椐检出大肠菌群的管数，按表2报告供试品每1g或1ml的大肠菌群数。 梭菌（Clostridium）取供试液10ml（相当于供试品1g、1ml）2份，其中1份置80℃保温10min后迅速冷却。上述2份供试液直接或处理后分别接至100ml的0.1%新鲜庖肉培养基中。阴性对照加入的稀释剂为10ml。各培养基管在厌氧条件下培养72～96小时。如试验管不出现混浊、产气、消化碎肉、臭气等现象，判供试品未检出梭菌；否则，应取上述培养物0.2ml，涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上，在厌氧条件下培养48～72小时。若平板上无菌落生长，判供试品未检出梭菌；若平板上有菌落生长，应挑选2～3个菌落分别进行革兰染色和过氧化氢酶试验。 过氧化氢酶试验取上述平板上的菌落，置洁净玻片上，滴加3%过氧化氢试液，若菌落表面有气泡产生，为过氧化氢酶试验阳性，否则为阴性。若上述可疑菌落为革兰阳性梭菌，有或无卵圆形或球形的芽孢，过氧化氢酶阴性，判供试品检出梭菌，否则判供试品未检出梭菌。 结果判断原规定5条，删去了1条。这4条的先后顺序做了调整，突出重点。供试品若检出控制菌或其他致病菌，按一次检出为准，不再抽样复试。3种菌数任一项不合格，应从同一批样品中随机抽样，复试2次，以3次结果均值报告。眼科用药的霉菌和酵母菌菌数复试报告，须以2次复试结果均不得长菌，方可判供试品不合格。3种菌数和控制菌任一项不合格，判该供试品不符合规定。删去了在特殊情况下，营养琼脂培养基上长霉菌、酵母菌，玫瑰红钠琼脂培养基上长细菌，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数多的培养基中的菌数判断结果。 ●培养基增订乳糖胆盐发酵培养基，乳糖发酵培养基；庖肉培养基，0.1%葡萄糖庖肉培养基，哥伦比亚琼脂培养基。原培养基中的错别字已订正。●试药一部增订11种；二部增订7种。●试液增订4种。●稀释剂增订2种。pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液无菌聚山梨酯80氯化钠-蛋白胨缓冲液。 名词统一震荡-振摇、三角瓶-锥形瓶、大肠杆菌-大肠埃希菌、绿脓杆菌-铜绿假单胞菌、破伤风杆菌-破伤风梭菌、混匀-摇匀、平皿-平板、菌苔-新鲜菌苔、生药-药材、革兰氏染色-革兰染色、沙门氏菌-沙门菌、…… 中国药典2005版微生物限度标准非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径、对患者健康潜在的危害而制订的。药品的生产、储存、销售及新药标准制订、进口药品标准复核、考察药品质量、仲裁、原料及辅料等检验中，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。 中国药典2005版一部微生物限度标准1.制剂通则、品种项下要求无菌的制剂及标示无菌的制剂应符合无菌检查法规定。2.口服制剂2.1不含药材原粉的制剂细菌数1g不得过103个。1ml不得过102个；霉菌和酵母菌数1g或1ml不得过102个；大肠埃希菌1g或1ml不得检出。2.2含药材原粉的制剂细菌数1g不得过104个（丸剂1g不得过3×104个）；1ml不得过5×102个；霉菌和酵母菌数1g或1ml不得过102个；大肠埃希菌1g或1ml不得检出；大肠菌群数1g小于102个，1ml小于10个。2.3含豆豉、神曲等发酵成分的制剂细菌数1g不得过105个。1ml不得过103个；霉菌和酵母菌数1g不得过5×102个。1ml不得过102个。大肠埃希菌1g或1ml不得检出；大肠菌群数1g小于102个，1ml小于102个。 3.局部给药制剂3.1用于手术、创伤的局部给药制剂，应符合无菌检查法要求。3.2一般外用局部给药制剂3.3用于表皮或黏膜完整的含药材原粉局部给药制剂细菌数1g、1ml或10cm2不得过104个。1ml不得过102个。3.4眼部给药制剂金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌1g或1ml不得检出。3.5耳、鼻及呼吸道吸入给药的制剂大肠埃希菌鼻及呼吸道吸入给药的制剂1g或1ml或10cm2不得检出不得检出。3.6阴道、尿道给药制剂细菌数1g或1ml不得过102个。霉菌和酵母菌数1g或1ml小于10个。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、梭菌1g或1ml不得检出。3.7直肠给药制剂金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌大肠埃希菌1g或1ml不得检出。 4.含动物组织（包括提取物）及动物类原药材粉（蜂蜜、王浆、动物角、阿胶除外）的口服制剂，10g或10ml不得检出沙门菌。5.有兼用途径的制剂，应符合个给药途径的标准。6.霉变、长螨者，以不合格论。7.中药提取物及辅料参照相应制剂的微生物限度标准执行。 中国药典2005版二部微生物限度标准非无菌药品的微生物限度标准是基于药品的给药途径、对患者健康潜在的危害而制订的。药品的生产、储存、销售及新药标准制订、进口药品标准复核、考察药品质量、仲裁、原料及辅料等检验中，除另有规定外，其微生物限度均以本标准为依据。1.制剂通则、品种各论中要求无菌的制剂及标示无菌的制剂应符合无菌检查法的规定。2.口服给药制剂细菌数1g不得过103个。1ml不得过102个。霉菌和酵母菌数1g或1ml不得过102个。含糖、蜂蜜、王浆的液体或半固体制剂，酵母菌和霉菌总数，1g或1ml不得过102个。大肠杆菌1g或1ml不得检出。 3.局部给药制剂3.1用于手术、创伤的局部给药制剂，应符合无菌检查法要求。3.2一般局部给药制剂细菌数1g、1ml或10cm2不得过102个。霉菌数1g、1ml或10cm2不得过102个。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌1g、1ml或10cm2不得检出。3.3眼部给药制剂细菌数每1g、1ml不得过10个。霉菌数酵母菌数1g或1ml不得检出。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌1g或1ml不得检出。3.4耳、鼻及呼吸道吸入给药的制剂细菌数1g、1ml或10cm2不得过102个。霉菌和酵母菌数1g、1ml或10cm2不得过10个。金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌1g、1ml或10cm2不得检出。大肠埃希菌鼻及呼吸道给药的制剂，1g或1ml或10cm2不得检出。3.5阴道给药制剂细菌数1g或1ml不得过102个。霉菌和酵母菌数1g或1ml不得检出。 麻疹病例监测桦甸市疾病预防控制中心 监测目的（一）及时发现麻疹病例，采取针对性措施，预防和控制疫情。（二）了解麻疹流行病学特征，分析人群免疫状况，确定易感人群，加强预测预警。（三）了解麻疹病毒学特征，追踪病毒来源、传播轨迹。（四）评价预防控制效果，为适时调整消除麻疹策略措施提供依据。 麻疹疑似病例定义是什么 监测病例定义麻疹疑似病例定义为：具备发热、出疹，并伴有咳嗽、卡他性鼻炎或结膜炎症状之一者；或传染病责任疫情报告人怀疑为麻疹的病例。所有麻疹疑似病例均作为监测对象。 监测病例分类1.实验室诊断病例（1）麻疹疑似病例血标本检测麻疹IgM抗体阳性者。（2）从麻疹疑似病例的标本中分离到麻疹病毒或检测到麻疹病毒基因者。2.临床诊断病例（1）麻疹疑似病例无标本，或出疹后3天内采集的血标本检测麻疹/风疹IgM抗体均为阴性，且无其他原因可以明确解释者。（2）麻疹疑似病例出疹后4-28天采集的血标本检测麻疹/风疹IgM抗体均为阴性，但与实验室诊断麻疹病例有明确流行病学联系，且无其他明确诊断者。 3.排除病例（1）麻疹疑似病例血标本检测麻疹IgM抗体阴性、风疹IgM抗体阳性，或经实验室确诊为其他发热出疹性疾病者。（2）麻疹疑似病例无标本，或出疹后3天内采集的血标本检测麻疹IgM抗体阴性，但有其他原因可以明确解释者（如与风疹实验室确诊病例有流行病学联系）。（3）麻疹疑似病例出疹后4-28天采集的血标本麻疹IgM抗体阴性，但与实验室诊断麻疹病例无明确流行病学联系或有其他明确诊断者。 分类示意图 麻疹报告时限已经具备网络直报条件的医疗机构，应按照网络直报要求报告；对尚不具备网络直报条件的医疗机构，应采取最快的方式进行快速报告，城市必须在小时以内，农村必须在小时以内报至当地县级疾病预防控制机构，同时在24小时内寄出传染病报告卡。 监测内容1、病例报告在消除麻疹阶段,为提高报告及时性，根据《行动计划》的要求，已经具备网络直报条件的医疗机构，应按照网络直报要求尽快报告；对尚不具备网络直报条件的医疗机构，应采取最快的方式进行快速报告，城市必须在6小时以内，农村必须在12小时以内报至当地县级疾病预防控制机构，同时在24小时内寄出传染病报告卡。 监测内容学校、托幼机构发现麻疹病例或麻疹疑似病例，按照《学校和托幼机构传染病疫情报告工作规范》要求报告。在同一学校、幼儿园、自然村寨、社区、建筑工地、厂矿等集体单位7天内发生10例及以上麻疹疑似病例，应按《国家突发公共卫生事件相关信息报告管理工作规范》的要求报告。 标本的采集医疗单位做什么？未就诊麻疹疑似病例的血标本由谁来采集？出疹后3天内采集的血标本检测麻疹IgM抗体阴性或可疑的病例，是否采集第二份血？当发生麻疹暴发疫情时，采集出疹早期病例的哪些标本？ 标本的采集医疗单位负责对就诊的麻疹疑似病例采集血标本，完整填写标本送检表，并立即通知县级疾病预防控制中心。未就诊麻疹疑似病例，由县级疾病预防控制中心负责组织采集血标本。出疹后3天内采集的血标本检测麻疹IgM抗体阴性或可疑的病例，应在出疹后4-28天采集第2份血标本。当发生麻疹暴发疫情时，县级疾病预防控制中心应按要求组织采集出疹早期病例的鼻咽拭子、尿液等标本，及时送省级麻疹实验室进行病毒分离。 采集的血标本应在24小时内送至县级疾病预防控制中心。县级疾病预防控制中心收到标本后，将血清和标本送检表在48小时内送市疾控中心麻疹血清学实验室。合格血标本的基本要求是：出疹后28天内采集，血清量不少于0.5ml，无溶血，无污染；2～8℃条件下保存、运送。标本运送 实验室检测要求承担血清学检测任务的麻疹实验室在收到疑似病例血清标本后，应于3天内完成麻疹IgM抗体检测，麻疹IgM抗体阴性的标本应在一周内完成风疹IgM抗体检测，以进行鉴别诊断。 麻疹疑似病例的调查负责调查的专业人员应在接到报告后48小时内完成流行病学调查，填写“麻疹疑似病例流行病学个案调查表”。县级疾病预防控制中心要及时收集麻疹疑似病例流行病学个案调查表，并在完成调查后的48小时内录入麻疹专病监测信息报告管理系统。 现阶段麻疹暴发定义是什么？麻疹暴发的定义麻疹暴发是指在一个局部地区，短期内突然发生较多的麻疹病例。现阶段麻疹暴发定义为：以村、居委会、学校或其他集体机构为单位，在10天内发生2例及以上麻疹病例；或以乡、镇、社区、街道为单位10天内发生5例及以上麻疹病例。 主动监测县级疾病预防控制中心和乡镇级预防保健单位，按照《预防接种工作规范》的要求，每旬到辖区内相关医疗单位进行麻疹疑似病例的主动监测，并记录主动监测完成情况。 信息的录入和管理麻疹疑似病例的传染病报告卡信息由病例报告单位录入疾病监测信息报告管理系统；流行病学个案调查信息由县级疾病预防控制中心于调查完成后2日内录入麻疹监测信息报告管理系统（有关工作规范由中国疾病预防控制中心另行制定）；实验室检测结果由检测单位于检测完成后24小时内录入麻疹监测信息报告管理系统，并将检测报告反馈至标本送检单位。 麻疹监测系统敏感性指标？监测指标（一）监测系统敏感性指标。以省为单位，麻疹监测病例中的排除病例报告发病率达到2/10万以上，同时80％以上的县区麻疹排除病例报告发病率达到1/10万。（二）监测系统及时性指标。麻疹疑似病例48小时完整调查率达到80％以上，实验室血清检测结果7天内及时报告率达到80％以上。（三）监测系统特异性指标。麻疹疑似病例血标本采集率达到80％以上，麻疹暴发疫情血清学确诊率到达90％以上，采集病原学标本的暴发疫情数占暴发疫情总起数的百分比达到80％以上 医疗单位的职责负责麻疹病例的报告和就诊病例的标本采集工作，协助各级疾病预防控制中心完成流行病学调查和标本运送工作；对本单位医护人员进行培训；严格按照有关要求对病人进行隔离和医疗救治，避免医院感染的发生。'