最新医学免疫学课件PPT 22 免疫学检测技术的基本原理-药学医学精品资料.ppt 67页

'最新医学免疫学课件PPT22免疫学检测技术的基本原理-药学医学精品资料 主要内容抗原和抗体的体外实验免疫细胞功能的测定2 免疫学检测技术：运用免疫学原理设计的检测方法可用于：诊断免疫相关性疾病探讨发病机制监测病情和治疗效果3 抗原与抗体的种类：抗原的类型：颗粒性抗原：细胞，细菌，人工微球/珠可溶性抗原：细胞成分，蛋白分子，小分子化合物7 抗体的类型：多克隆抗体(抗血清):识别多个表位，特异性差单克隆抗体：识别单个表位，特异性好抗-抗体（二抗）：抗异种Ig的抗体8 二、抗原或抗体的检测方法（一）凝集反应：（agglutination）颗粒性抗原（或可溶性抗原吸附在与免疫无关的载体上）与相应抗体在适当条件下形成肉眼可见的凝集小块。9 1、直接凝集反应：天然颗粒性抗原（细菌或细胞）与相应抗体直接结合所出现的凝集现象：（1）玻片法—定性试验：已知Ab未知Ag(?)ABO血型鉴定，细菌种属抗原型别的鉴定+10 （2）试管法—半定量试验：诊断伤寒副伤寒的“肥达氏反应”病人血清倍比稀释伤寒细菌悬液1:21:41:81:161:321:64对照11 2、间接凝集反应：++—载体：红血球：间接血凝试验12 （二）沉淀反应(precipitation)：可溶性性抗原与相应抗体直接结合，在适当条件下形成肉眼可见的沉淀现象（沉淀线）。1、单向免疫扩散(radicalimmunodiffusion)：可定量检测Ag13 含抗人IgG琼脂制成平板待测血样(IgG浓度?)标准人IgG不同浓度制作标准曲线待测样品结果14 2、双向免疫扩散(doubleimmunodiffusion)：----定性检测Ag或Ab；Ab效价滴定AgAb扩散AgAb扩散1:21:41:81:161:241:6415 16 ３、免疫电泳（immunoelectrophoresis)+标本先电泳**************************两侧挖槽加Ab孵育后出现肉眼可见沉淀-17 18 4、火箭电泳：单扩试验+电泳可定量分析19 5、免疫比浊：Ag＋AbAg-Ab（免疫复合物）比浊仪测量浊度，计算抗原含量目前替代单扩测量血清Ig20 （四）免疫标记技术－用标记抗体或抗原进行抗原抗体反应：利用荧光素、酶、放射性同位素以及胶体金标记抗体，以检测相应抗原的技术1、免疫荧光技术（immunofluorescencetechniques）利用荧光素标记抗体或抗抗体以检测细胞表面或细胞内抗原的技术。21 1、免疫荧光技术（immunofluorescencetechniques）直接法间接法22 23 间接免疫荧光检测自身抗核抗体24 用酶标记Ab(或Ag)与标本中的Ag(或Ab)发生特异性结合加入酶的底物，在酶作用下产生有色物质根据颜色可作出判断或测量光密度值免疫酶标技术：酶联免疫吸附试验（enzymelinkedimmunosorbentassay，ELISA）2、免疫酶标技术：25 （1）双抗体夹心法：+++26 （2）间接法+++27 28 3、放射免疫测定（radioimmunoassay，RIA）：利用放射性同位素标记技术检测抗原的技术灵敏度高，用于检测激素等血清中微量物质29 4.免疫胶体金标记技术(immunologiccolloidalgoldsignature，ICS)胶体金颗粒表面带有较多电荷，用胶体金颗粒标记抗体，检测组织或细胞标本中的抗原。30 常用方法：胶体金斑点渗滤试验胶体金斑点免疫层析试验BDCTA31 第二节免疫细胞测定一、淋巴细胞的分离与类型鉴定外周血单个核细胞(peripheralbloodmononuclearcell,PBMC)包括淋巴细胞和单核细胞。红细胞和多核白细胞密度：为1.092左右，淋巴细胞和单核细胞密度：1.075～1.090，血小板密度：1.030～1.035。聚蔗糖－泛影葡胺(Ficoll):1.077±0.00132 一、免疫细胞的分离：（一）外周血单个核细胞（PBMC）的分离：方法：密度梯度离心法分离液：聚蔗糖泛影葡胺（比重：1.077±0.001）稀释全血分离液RBC粒细胞PBMC稀释血浆33 （二）T、B细胞的纯化：贴壁法——去除单核细胞花环沉降法、尼龙毛法——分离T、B细胞（三）免疫磁珠分离法：（四）FACS分离法：34 二、T细胞数量检测：1、E花环试验：原理：T细胞均有CD2分子，而B细胞无;将SRBC与人外周血淋巴细胞混合;SRBC可结合于T细胞周围形成花环细胞。35 2、免疫荧光标记技术：用荧光素标记CD3、CD4或CD8单抗与淋巴细胞混合经荧光显微镜观察或用流式细胞仪测定36 37 38 三、NK细胞杀伤功能检测：-----NK细胞具有非特异杀伤肿瘤活性，在体外与肿瘤细胞混合，可被激活而杀伤肿瘤细胞取外周血淋巴细胞（含NK细胞）与K562（白血病细胞株）混合，孵育4h通过形态学或细胞计数方法检测K562肿瘤细胞被杀伤的数量计算NK细胞的杀伤活性39 四、白细胞功能测定（一）、T细胞功能测定１、Ｔ细胞增殖试验T细胞对特异和非特异性抗原的识别过程不同，但被激活后，诱发的分裂和增殖过程却是相同。用T细胞敏感刺激物体外刺激T细胞，T细胞发生增殖、转化，根据增殖转化能力评价T细胞功能。40 形态学特征:体积增大4---5倍;核染色体疏松;核仁明显;胞浆出现空泡。1、T淋巴细胞转化试验：41 （１）3H-TdR细胞周期外周血中T细胞通常处于细胞周期的G0期，受特异性抗原或促有丝分裂原激活后，从G0期进入G1期，并合成蛋白质、RNA和DNA前体物质等，为DNA复制准备物质基础，然后进入S期，细胞合成DNA量倍增，此时若在培养液中加3H标记的DNA前体(3H-胸腺嘧啶核苷，3H-TdR)，后者即掺入新合成的DNA中，根据掺入的多少推测细胞增殖程度。42 将单个核细胞悬液加入含培养液的试管中，实验管加适量PHA后，空白对照不加PHA，置5％CO2温箱37℃培养56h，加适量3H-TdR，继续培养16h，收集细胞，用液体闪烁器测量，记录每分钟脉冲数(cpm)，刺激指数(SI)表示转化能力。SI＝PHA刺激管cpm均值/对照管cpm均值SI＞243 （2）MTT法单个核细胞与PHA混合培养70h后，加入四甲基偶氮唑盐（MTT）后再培养4~6h，MTT在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下，被还原成蓝黑色的MTT-甲，形成MTT-甲的量与细胞增殖程度正相关，测OD值：SI=试验孔OD值/对照孔OD值44 ２、细胞毒试验CTL、NK细胞对靶细胞有直接杀伤作用，依据待检细胞的性质，选用相应靶细胞，根据靶细胞破坏程度，鉴定相应细胞的功能。45 3.细胞因子的检测1)、免疫学检测：ELISA细胞增殖法：IL-1、IL-2等靶细胞杀伤法：TNF2)、生物活性检测法3)、分子生物学方法:RT-PCR检测mRNA46 细胞因子检测可了解免疫调节，了解淋巴细胞亚群。免疫学检测法（1）双抗体夹心法（2）ELISPOT（3）FCM法47 （2）生物活性测定法根据细胞因子的生物学活性，选用相应实验系统：细胞增殖法直接杀伤法保护细胞免受病毒致病变法48 （3）分子生物学方法：检测基因表达RT－PCR法根据细胞因子的核酸序列，设计引物，利用逆转录PCR测定特定细胞因子的mRNA的表达。49 4、皮肤试验（体内实验）结核菌素皮肤试验：即OT/PPD皮试。---反映体内细胞免疫功能水平。以迟发型超敏反应检测细胞免疫功能。50 （二）B细胞功能测定（１）B细胞增殖试验LPS、SPA、抗IgM抗体B细胞受丝裂原刺激后分裂增殖，培养一定时间后计数抗体形成细胞的数目。51 （2）抗体形成细胞测定溶血空斑形成试验PBMC或组织来源的淋巴细胞、SPA-致敏的羊红细胞（SPA-SRBC）、抗人Ig抗体及补体4种成分混合在溶化的0.5%琼脂糖内，注入密封小室内。抗人Ig的Fc段与SPA-SRBC结合，抗体形成细胞分泌的Ig与抗人Ig结合后活化补体，导致SRBC溶血，形成一个肉眼可见的圆形透明溶血区而成为溶血空斑（plaque）。每一个空斑表示一个抗体形成细胞。52 （三）吞噬细胞功能测定１、趋化功能测定（１）、Boyden小室法由上下两室组成，中间隔以8μm的微孔滤膜。检测细胞置于上室，趋化因子置于下室，如被趋化因子吸引，细胞通过滤膜并爬行于滤膜下侧，染色、计数可知趋化情况。53 （２）、琼脂凝胶法（３）、过氧化物酶法中性粒细胞内含有过氧化物酶，趋化后溶解细胞，加入过氧化物酶底物二甲氧苯胺，，405nm比色，以反映趋化活性。54 2、吞噬功能测定（１）、硝基蓝四氮唑试验在白细胞中加入硝基蓝四氮唑试验溶液，中性粒细胞在杀菌过程中产生ROI，其中超氧阴离子能使被吞噬进细胞的NBT还原成不溶解的暗兰色甲，沉积于胞浆中，称NBT阳性细胞，反映吞噬功能。55 （２）荧光标记物试验将荧光素标记的生物颗粒（如白色念珠菌等）与白细胞混合后，温育一定时间后加入台盼蓝并洗涤，以除去未被吞噬的荧光颗粒，离心收集细胞，重悬后用荧光分光光度计定量分析。56 第三节免疫学检测方法的应用一、免疫学检测方法的评估与选择金标准：公认可靠的诊断方法。特异性：用某方法检查非患者时出现阴性的可能性特异性＝真阴性/（真阴性＋假阳性）X100％敏感性：用该方法检查患者时出现阳性的可能性。敏感性＝真阳性/（真阳性＋假阴性）X100％57 １、感染性疾病２、免疫缺陷病３、自身免疫病４、超敏反应性疾病５、肿瘤二、疾病的诊断58 １、感染性疾病：动态观察病原体与抗体的消长２、HIV感染与免疫缺陷病：动态观察CD4+T细胞数量３、肿瘤患者：动态监测察肿瘤相关抗原的水平4、器官移植患者：动态观察T细胞活化标志的表达三、免疫学监测59 质量验收内容（喷涂）作业顺序杂色杂点外观质量凹凸点/缩孔露底塑粉堆积缝隙/打磨印光泽度/粗糙度附着力颜色涂层厚度堆放丝牙等保护 前处理工艺流程前处理干燥水洗水洗磷化表调水洗酸洗除油脱脂→→→→→→→ 前处理工件装框要求平面与平面之间应隔离尽量消除气体封闭状态将锈蚀较严重的工件集中装框平板工件应侧装大件、重件不得压在平板件和箱体件上工件不能挤压过紧，有一定的松散状态油污重的工件集中装框局部油污重的工件需先用脱脂剂擦拭后再装框 前处理过程要求序号工序工艺参数操作要求质量要求1脱脂脱脂剂配比：定期清理脱脂槽表面的分离油污工件表面无油污2配比：5%-10%脱脂十分钟，吊烂一次，调整溶液均衡工件能被谁浸蚀，水膜连续3PH值：12-14工件脱脂水洗后，半分钟滴干4时间：25-40脱脂后的水池PH值为6-7，高于8需换水5若规定时间内油污未除尽，需增加脱脂剂67酸洗后的水洗工件酸洗后应尽快水洗8工件暴露于空气中的时间，不超过半分钟9水洗槽水质洁净，PH值不低于510表调工艺配比：0.3%经常检测PH值，及时补加表调剂11PH值：8.0-9.0使用时间过长，溶液老化，需整槽更换时间：1-2分钟 前处理过程要求（2）序号工序工艺参数操作要求质量要求1磷化磷化液配比：气温过低，槽液浓度应升高，时间应加长2总酸度：25-40磷化液补充，每框定量添加，每天测试结晶细密，磨蹭均匀一致3游离酸度：1.5-2促进剂调整：生产前测试补充，冷板浓度6-8个点，热板、矩管等浓度10-12个点，冬季可升高2-3-个点4酸比：10%磷化液和促进剂在吊栏未入池前添加无花斑，无挂灰，无泛彩现象5时间：25-35吊栏出池前需在池内上下反复吊动几次6平板类工件或小件，隔十分钟吊动几次7磷化后的水洗磷化后的水洗应反复进行，时间1-2分钟，水洗槽pH值6-7，低于5需整槽更换，最好采用循环水8每周定期打捞池中沉淀物9干燥板状不能重叠摆放，应隔离10小件应分散性摆放，大件应倾斜摆放11封闭式管状应加温烘烤干燥12有条件可采用烤干或风干进行干燥 前处理过程要求（3）序号工序工艺参数操作要求质量要求1彩膜磷化磷化液配比：磷化液补充：每天测试补加，PH值控制在2-3，PH值大于3时需添加磷化液结晶细密，膜层为彩灰色，时间短以蓝色为主，时间稍长出现黄或金黄色，时间再长出现红色或红黄色2配比：10%磷化液的添加在吊栏未入池前进行3时间：8-15分钟平板类工件或小件，隔5分钟吊栏一次4干燥板状不能重叠摆放，应隔离5小件应分散性摆放，大件应倾斜摆放6封闭式管状应加温烘烤干燥7有条件可采用烤干或风干进行干燥 喷涂缺陷色号与色差.....杂色杂物缩孔露底 喷涂外观等级面划分ABAAAB等级面划分A级面：装配后经常看到的外表面，如机柜门，面板，四周侧面。B级面：不经常看到，打开后才看到的内部。C级面：一般看不到，如被装配件遮挡面。'