最新噬菌体展示肽在促进药物透过皮肤和血脑屏障中的应用课件PPT.ppt 58页

'噬菌体展示肽在促进药物透过皮肤和血脑屏障中的应用 体内噬菌体展示技术促进药物透过皮肤屏障促进药物透过血脑屏障展望主要内容 体内噬菌体展示技术噬菌如命的噬菌体 淘选（Panning） Ruoslahti等于1996年首次将噬菌体肽库直接注射到小鼠体内进行筛选，得到了与小鼠肾、脑血管结合的小肽。体内噬菌体展示技术（InVivoPhageDisplay，IVPD） IVPD＋DrugDelivery＝??? 噬菌体展示肽促进药物透过皮肤屏障皮肤屏障通过噬菌体文库筛选透皮肽透皮肽对胰岛素透皮的影响透皮肽携带胰岛素透皮的特性透皮肽携带胰岛素透皮的作用机制透皮肽携带其它大分子药物透皮 皮肤屏障皮肤的组成表皮基层棘层粒层透明层角质层真皮皮下组织附属器汗腺皮脂腺毛囊 皮肤的屏障作用防护机械性伤害防护物理性伤害防护化学性伤害防护生物性伤害防止体内有用物质的丧失 药物透皮吸收的主要途径药物从介质中释放表皮皮脂层通过表皮通过附属器角质层细胞间细胞内活性表皮毛囊皮脂腺汗腺真皮毛细血管吸收 角质层是药物透皮吸收的主要屏障正常情况下药物通过角质层渗透，通过附属器的渗透可以忽略。角质层的渗透是限速过程。 通过噬菌体文库筛选透皮肽Ph.D.-C7CabdominalskinfromthebloodPH-1噬菌体（CSSSPSKHC）TD-1（ACSSSPSKHCG） PH-1噬菌体具有穿透皮肤的高效性与特异性。PH-1噬菌体透皮能力？InvitroInvivo 一定量的TD-1对PH-1的透皮效果有抑制作用，进一步说明PH-1之所以能够穿透皮肤屏障是展示肽在发挥作用。TD-1对PH-1噬菌体透皮的抑制效应？TD-1(μg)AP-1(μg)AP-1ACNATLPHQCG 发现TD-1对对照噬菌体SC的透皮反而增强20%。由于噬菌体衣壳是蛋白质，提示TD-1可能促进蛋白药物穿透皮肤。TD-1对蛋白药物透皮的影响？ 透皮肽对胰岛素透皮的影响 TD-1携带125I-胰岛素应用于大鼠腹部皮肤，2h后血液中的放射性含量都明显高于没有TD-1组，并且持续24h。说明TD-1肯定能够携带125I-INS进入体内。TD-1对125I-胰岛素透皮的影响？ TD-1携带胰岛素透皮的生物学功能？胰岛素本身不能透过皮肤，但与TD-1在生理盐水中简单混合即能穿透皮肤，并且产生降糖效果，涂抹糖尿病模型大鼠腹部皮肤2h后血清胰岛素水平开始上升，5h上升达峰值，11h左右回到基础值，相应地2h后血糖开始降低，8h血糖水平降到最低并能维持至11h。 透皮肽携带胰岛素透皮的特性应用不同剂量TD-1与70μg胰岛素协同透皮，TD-1携带胰岛素透皮发挥生物学功能具有TD-1剂量依赖性，500μgTD-1己达饱和。剂量依赖性 应用500μgTD-1与不同剂量胰岛素协同透皮，TD-1携带胰岛素透皮发挥生物学功能具有胰岛素剂量依赖性，70μg胰岛素己达饱和。 序列依赖性以TD-1序列为基础合成不同的TD-1变种，与TD-1比较携带胰岛素透皮能力减少了很多。TD-1两侧的A与G在稳定性方面可能起比较重要的作用，TD-1含有二硫键在协助胰岛素透皮可能起比较重要的作用。 作用时效性先用TD-1处理糖尿病模型大鼠腹部皮肤5min，清洗干净后不同的时间点给予胰岛素。洗净后立即给予胰岛素和TD-1与胰岛素协同给予没有多大差别，随给药时间延后效果逐渐降低，15min下降显著，60min则基本失去了作用。 TD-1携带胰岛素透皮的作用机制？胰岛素是含有51个氨基酸的小分子蛋白质，分子量为6000，胰岛素分子有靠两个二硫键结合的A链（21个氨基酸）与B链（30个氨基酸），在不同pH下有不同的聚集体形式。 TD-1促透机制与其它促渗技术不同化学促渗剂：a经皮扩散—乱角质层结构；离子电渗透法：b低电压促渗—毛囊、汗腺；电致孔术：c高电压促渗—打乱脂质双分子层，跨细胞通道；超声导入法：a和c—打乱脂质双分子层；微针和热穿孔技术：d—微孔 logPTD-1＝-3.03具有亲水性TD-1促透机制与化学促渗剂不同 TD-1促透机制与和胰岛素直接作用无关放射性与酶法检测均表明TD-1与胰岛素之间没有直接结合。 通过荧光闪射检测证实TD-1对胰岛素构象没有影响TD-1对不同结构形式的胰岛素透皮效率没有多大影响。 荧光显微镜观察皮肤切片a和e：10μginsulin-FITC＋100μgTD-1b和f：10μginsulin-FITC＋100μgAP-1c和g：10μginsulin-FITCd和h：10μginsulin-FITC＋0.5%SLA/PP给药后2h切片观察，切片深度皮下600μm先用TD-1处理大鼠腹部皮肤5min，清洗干净后，0(i),5(j),15(k)or60(l)min给予10μginsulin-FITC。 10μginsulin-FITC＋100μgTD-1大鼠腹部给药，不同时间0(a)、30min(b)、1h(c)、2h(d)、5h(e)、24(f)片观察。将TD-1标上FITC后，应用于大鼠皮肤，行皮肤切片直接观察TD-1-FITC在皮肤的行为；对照肽SC-1-FITC（FITC-HPGARPVFPWPG） TD-1介导INS-FITC的荧光集中在毛囊，并且能够到达皮肤深层；对照肽AP-1与生理盐水没有荧光；SLA/PP介导INS-FITC虽然有少量荧光，但主要在皮肤表面，而且分布在整个皮肤；清洗后立即给予INS-FITC可以明显的看到绿色荧光，而60min后看不到绿色荧光；TD-1-FITC也集中在毛囊，而对照肽SC-1-FITC没有荧光；TD-1介导胰岛素透皮进入血液发挥生物学功能作用机制有可能是通过毛囊进入血液，而且这过通道是瞬间的。 TD-1携带其它大分子药物透皮生长激素100μg，500μgTD-1与500μghGH协同应用于去垂体模型大鼠，均在2h左右血液hGH含量达到高峰，而对照肽AP-1没有活性。PT-141、阿朴吗啡 噬菌体展示肽促进药物透过血脑屏障血脑屏障鼻脑肽的研究选择性定位在脑部血管内皮上的多肽 血脑屏障血脑屏障因其屏障作用，对维持正常机体中枢神经系统功能具有极其重要的作用，但在病理状态下，又有可能成为药物治疗的瓶颈。 鼻脑肽的研究嗅神经通路嗅黏膜上皮通路血液循环通路 通过噬菌体文库筛选鼻脑肽将M13噬菌体展示文库Ph.D.-c7cTM和Ph.D.-12TM经鼻腔给予后，从大脑组织回收噬菌体，经三轮筛选，获得特异性的噬菌体。 十个单克隆测序结果及同源性分析随机挑取10个单克隆噬菌体，经扩增、测序，发现没有完全相同的插入序列。 7号单克隆噬菌体入脑的特性剂量—梯度效应序列特异性 组织特异性肽（NB-101）-7号噬菌体竟争抑制 7号单克隆噬菌体入脑途径嗅神经与脑中滴度嗅神经免疫组化 FTTC-NB-101(肽)在嗅神经中富集效应入脑途径：鼻—脑嗅神经通路 选择性定位在脑部血管内皮上的多肽血管内皮细胞标志分子是一组异质性蛋白，其异质性在于不同组织器官的内皮细胞上存在组织特异性的抗原。 通过噬菌体文库筛选多肽 随筛选次数增加，单位脑重所含的噬菌体数目逐渐增加。通过对多个噬菌体单克隆的测序，得到了六个特异的多肽序列。 备选克隆的组织分布3个多肽在脑组织中有明显分布，是CSKTAEHTC、QLADTTHHRPWP和SWASLPVGMNSW。其中CSKTAEHTC在肾、肺分布较多，QLADTTHHRPWP在肾、肺分布较少，SWASLPVGMNSW在脑中分布远低于肺中。 备选克隆的免疫组化染色CSKTAEHTCQLADTTHHRPWP 展望将体内噬菌体展示技术用于筛选能增强药物透过皮肤、血脑屏障的肽，是极具创新性的，也提供了引人注目的研究结果，揭示了一种药物（特别是大分子蛋白类）传递的新策略景。虽然此方向的研究目前处于探索阶段，还有许多问题需要进一步研究，比如展示肽作用机理的阐明，能否携带其它药物或毒物，工业化获得途径，安全性研究等方面，但它所展现出的潜力和应用前景非常值得我们继续深入地研究。 谢谢！ 25*夜莺的歌声 读读课文，说说课文讲了一件什么事，被游击队员称作小夜莺的那个孩子，给你留下了怎样的印象；课文最后的两个自然段和开头的三个自然段有什么联系，从这样的开头、结尾中，你读懂了什么。 夜莺的歌声小男孩（夜莺）怎么会就剩下我一个？野兽来了学鸟叫、打、拾、踢球果是一种蘑菇吗？机智勇敢热爱祖国 战斗刚刚结束，一小队德国兵进了村庄。大道两旁全是黑色的碎瓦。空旷的花园里，烧焦的树垂头丧气地弯着腰。夜莺的歌声打破了夏日的沉寂。这歌声停了一会儿，接着又用一股新的劲头唱起来。第二天，在被烧毁的村子的围墙旁边，在那小路分岔的地方，孩子又穿着那件绿上衣，坐在原来那河岸边削什么东西，并且不时回过头去，望望那通向村子的几条道路，好像在等谁似的。从孩子的嘴里飞出宛转的夜莺的歌声。这歌声，即使是听惯了鸟叫的人也觉察不出跟真夜莺的有什么两样。 首尾呼应前后连贯 想一想你还知道哪些小英雄的机智勇敢的事迹？说出来，比一比，看谁知道得最多。说说我们应该从这些小英雄身上学习哪些优秀品质？如果你处在那样的环境里，你会像小英雄那样挺身而出吗？'