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'第二章天然药物化学成分提取分离鉴定方法与技术(色谱法)_PPT课件 碳酸钙（固定相）色素混合液石油醚(流动相）1906年，Tsweet发现色谱分离现象色谱柱色带2“像光谱中的光线一样，色素混合物的不同组分有规律地排列在碳酸钙柱上而彼此分离。”——Tsweet,《德国植物学报》,1906. 3柱色谱薄层色谱纸色谱高效液相色谱 3）吸附色谱的三要素9 溶解能力流动相溶质吸附剂吸附作用竞争在液-固吸附色谱中，溶质的保留和分离选择性决定于下列三个因素：10吸附作用 11硅胶：适用于中性和酸性成分氧化铝：适用于中性和碱性成分活性炭：非极性吸附剂聚酰胺：高分子聚合物,氢键吸附极性吸附剂a、吸附剂（固定相） 12硅胶（silica）SiO2XH2O酸性、亲水性吸附剂。结构：内部----硅氧交联结构→多孔结构→范德华力表面----有硅醇基→氢键吸附适用于中性或酸性亲脂性成分的分离。 13特性：1）极性吸附剂，“相似者易吸附”物质极性↑，吸附能力↑2）吸水→失活105～110OC烘干30分钟(可逆失水)→吸附力最大500OC烘干(不可逆失水)→活性丧失，无吸附力注意：活化温度不宜高，不宜分离碱性物质。 氧化铝（aluminiumoxide）极性吸附剂，最适于分离植物中的碱性或中性的亲脂性成分。有酸性、碱性和中性三种规格。吸附特性与硅胶类似，但碱性氧化铝不宜分离酸性物质。14 聚酰胺（polyamide）结构：--[CH2-CO-NH-]-n原理：氢键吸附学说15酰氨基与化合物（羟基、羧基及醌基）形成氢键吸附。 16用途：分离黄酮类、酚类、醌类、有机酸类及鞣质。影响吸附强弱的因素：1、流动相：水＞甲醇或乙醇＞丙酮＞氯仿＞稀氨水＞甲酰胺;2、分子结构：a、形成氢键数目多，吸附能力强。b、形成分子内氢键，吸附力减弱。C、芳香化合物中，共轭双键多，吸附牢。 化合物结构对聚酰胺吸附作用的影响形成氢键的数目成键基团位置双键的数目分子内氢键17课本第33页 活性炭（activatedcarbon）非极性吸附剂，对非极性物质具有较强的亲和力，在水中对溶质表现出强的吸附能力。从活性炭上洗脱被吸附的物质时，溶剂的极性越小，洗脱能力越强。18特别适合水溶性物质的分离。 b、溶剂（移动相）遵循“相似相溶”及“相似者易吸附”原理：极性吸附剂，溶剂的介电常数愈大，洗脱能力愈强；非极性吸附剂，溶剂的介电常数愈大，洗脱能力愈弱。c、被分离物质遵循“相似相溶”及“相似者易吸附”原理：对于极性吸附剂而言：被分离成分极性大，吸附牢，难以洗脱；被分离成分极性小，吸附力弱，容易洗脱。19一般化合物的极性按下列官能团的顺序增强：—CH2—CH2—，—CH2=CH2—，—OCH3，—COOR，>C=O，—CHO，—NH2，—OH，—COOH 四、操作方式1、薄层色谱法（TLC）*定义：将吸附剂均匀的铺在平板上，把要分离分析的样品点加到薄层色谱板上，然后用适当的溶剂系统展开，在一定的条件下显色或直接在日光或紫外光下观察所获得的斑点，从而达到分离、分析、鉴定的目的。20 1）薄层色谱的吸附剂和支持剂：在选用吸附剂或支持剂时，一般是根据被分离物质的化学性质来选用。当不了解被分离物质的化学性质时，可以先选用最常用的硅胶或氧化铝，如果分离效果不好，可再改用其他的吸附剂或支持剂。21 常用的硅胶吸附剂粒径：200-300目种类：硅胶G——硅胶+粘合剂煅石膏硅胶GF254——含有荧光物质硅胶H——不含粘合剂煅石膏硅胶HF254——含有荧光物质22 常用的展开剂正己烷、环己烷、四氯化碳、甲苯、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、乙醇、甲醇、水23理想的溶剂应能使混合物分离后各组分的Rf值相差尽可能大，且尽量在0.2-0.8之间。当单一溶剂不能很好地展开各组分时，常选择用混合溶剂作为展开剂。 2）薄层色谱的一般操作a、制板b、活化c、点样d、展开e、显色f、计算比移值24 操作技术——手工铺板取一份吸附剂和三份水（或另加黏合剂），在研钵中向一个方向研磨混合成均匀糊状（无气泡和结块），均匀涂布在薄层板上。玻璃板层析专用玻璃板，清洗干净用量10×20cm，3g硅胶黏合剂0.3～0.8%CMC-Na溶液，干燥水平台面，室温下自然完全晾干检查表面光滑平整，均匀，无杂质操作要点25 裂开的薄层板不能使用!操作技术—活化涂布后的薄层先在室温下阴干，至完全干透后，在使用前置适当温度烘烤一定时间进行活化，然后置干燥器中备用。硅胶105℃-110℃30-60min氧化铝105℃-110℃30min26 操作技术——点样定量微升毛细管薄层点样毛细管配制样品的溶剂具高度挥发性和尽可能非极性，否则易使斑点扩展。采用多次点加法，第二次点加时应待前一次点加的溶剂挥发后再进行。点样量应适中，过载会引起斑点拖尾，分离度变差。（1–5ul）27 点样示意图样品溶液的配制点样对照样反应混合液样点样直径≤2mm，1cm≤点间距≤1.5cm1-2cm28 C、展开薄层色谱的展开方式有上行、下行、单向、双向、多次、径向等多种方式。多数采用直线形上行展开，薄层板水平角度以75为最佳。29展开剂要接触到吸附剂下沿，但切勿接触到样点（0.5cm左右高度）。盖上盖子，展开。观察展开情况。取出薄层板 预饱和中展开中30预防边缘效应 操作技术——显色显色喷雾瓶三用紫外灯本身带有颜色本身无颜色含有荧光剂的薄层板有色斑点显色剂显色暗色斑点观察方法：日光、荧光、显色。31本身带有荧光荧光斑点 32 定义：样品经色谱分离后，某成分从原点至该成分斑点中心的距离与从原点至展开剂前沿的距离的比值称为该成分的比移值（Rf值）。原点至色谱斑点中心的距离比移值（Rf值）＝原点至展开剂前沿的距离33操作技术——测定比移值 0.2-0.8Rf值越大，化合物的极性？34 上样量大，常用于制备分离，是分离天然化学成分最常用的方法。定义：柱色谱是一种将分离材料装入柱状容器中,以适当的洗脱剂进行洗脱而使不同成分得到分离的色谱方法。2、柱色谱*35 其原理、吸附剂及洗脱剂的选择与薄层色谱法相同。操作步骤：注意点：上柱的样品须经过纯化处理（过滤、萃取、脱色、沉淀等）36 1）装柱实验室常用的柱内径与柱长之比通常为1:15－1:20。若柱粗而短，则分离效果较差。若柱过长而细，分离效果虽好，但流速慢，消耗时间太长。37 a、干法b、湿法：因湿法装柱容易赶走硅胶内的气泡，故一般以湿法装柱较好。38 2）上样39a、样品易溶于洗脱剂：湿法上上样b、样品难溶于洗脱剂：干法上样将样品溶解于少量洗脱剂，制成高浓度溶液后慢慢上柱。将样品溶解于少量甲醇或丙酮后，均匀拌入适量吸附剂（1:2-1:3），水浴挥干溶剂。均匀平铺至柱子顶端。 ①梯度洗脱：洗脱剂极性从小到大。②洗脱剂液面高度始终要高于柱面。③控制洗脱剂流速为匀速。④有色成分收集各色带洗脱液。⑤无色成分则采用等分收集。⑥浓缩洗脱液，薄层检识后合并相同流分。混合成分则进一步分离。3）洗脱40 植物色素分离图示41 42分配色谱法是以液体做固定相，用与其不相混溶的的溶剂做流动相的液-液色谱法。一、基本原理利用被分离成分在固定相和流动相中的溶解度不同。易溶于流动相的成分，移动速度快。易溶于固定相的成分，移动速度慢。分配色谱法*（DistributionChromatography） 溶解能力流动相溶质固定相竞争在液-液分配色谱中，溶质的保留和分离选择性取决于其在固定相和流动相中的溶解度：43溶解能力 二、分配色谱中的固定相和流动相固定相：被支持剂固定的溶剂。流动相：与固定相不相混溶的另一相溶剂。44支持剂固定相流动相待分离物质分配色谱四要素--固体--液体--液体 三、支持剂（载体、担体）在分配色谱中起到支持和吸着一定量固定相的作用，本身无吸附作用。要求：不与被分离成分反应。不溶于两相溶剂中。常用支持剂：含水硅胶、硅藻土、纤维素、滤纸45 适用范围：正相分配色谱：亲水性成分和弱亲脂性成分反相分配色谱：强亲脂性成分根据固定相和流动相相对极性大小不同：1、正相分配色谱极性：固定相>流动相2、反相分配色谱极性：流动相>固定相46四、分配色谱的类型 1、正相分配色谱：支持剂：硅胶等（硅胶吸水＞超过17％，不作吸附剂，而作为载体）固定相：强极性溶剂，如水、缓冲液等流动相：氯仿、乙酸乙酯等弱极性亲脂有机溶剂洗脱规律：47？极性小成分极性大成分--先洗下--后洗下 2、反相分配色谱：支持剂：硅胶、纤维素粉、滤纸等固定相：亲脂性极性小的有机溶剂，可用石蜡油、反相硅胶RP-18、RP-8、RP-2流动相：水或甲醇等强极性溶剂洗脱规律：48？极性大成分极性小成分--先洗下--后洗下 表2、分配色谱的类型类型固定相极性流动相极性分离速度正相分配大小极性小的分离速度快反相分配小大极性大的分离速度快49 50五、操作技术1、分配柱色谱法①先将支持剂和固定相拌匀②抽滤，除去多余的固定相③将含有固定相的支持剂倒入流动相中饱和④湿法装柱⑤洗脱用的流动相在使用前用固定相溶剂饱和 512、分配薄层色谱法支持剂：惰性物质固定相：支持剂吸附的溶剂流动相：事先要用固定相饱和装置及操作同吸附薄层色谱，区别在于制板用的是支持剂不是吸附剂。 3、纸色谱法（PC）系以纸为载体，以纸上所含水分为固定相，用展开剂进行展开的分配色谱。支持剂：滤纸（纤维素）固定相：水流动相：水饱和有机溶剂52用作微量分析，特别适合于亲水性较强的成分。化合物极性越小，Rf值越大；极性越大，Rf值越小。 53纸色谱与薄层色谱装置 离子交换色谱法（Ionexchangechromatography）基本原理：离子交换树脂上有可解离的阳离子或阴离子基团，能可逆性的与被分离成分上的离子基团发生交换，使混合成分中离子型与非离子型物质或具有不同离解度的离子化合物得到分离。操作方式：柱色谱54液-固色谱法固定相：离子交换树脂流动相：含强离子的水溶液 固定相：离子交换树脂（高分子化合物）球形颗粒，不溶于水，可在水中溶胀离子交换基团强酸性阳离子交换树脂结构图 适用范围：分离具有解离能力的酸性、碱性及两性化合物，如生物碱、有机酸、酚酸、氨基酸等。56离子交换树脂的种类（功能基团）：阳离子交换树脂：强酸性（-SO3-H+）弱酸性（-COO-H+）阴离子交换树脂：强碱性（-N+（CH3）3Cl-）弱碱性（-NH2OH，-NH-，-N=）被分离物质带负电荷被分离物质带正电荷 水提液中酸性、碱性、两性化合物的分离 凝胶过滤色谱法（Gelpermeationchromatography）原理：分子筛。固定相：凝胶（具多孔网状结构）葡聚糖凝胶（sephadexG）羟丙基葡聚糖凝胶（sephadexLH-20）流动相：水或有机溶剂58 59适用范围：分离分子量大小不同的化学成分，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、甾体等。洗脱顺序：分子量大的化合物先流出。 大孔吸附树脂色谱基本原理：利用大孔树脂具有吸附性和分子筛作用，使天然药物中相对分子量大小及吸附力强弱不同的化学成分得以分离。60液-固色谱法固定相：大孔吸附树脂流动相：溶剂 61固定相：大孔吸附树脂高分子聚合物多孔网状结构不含交换基团吸附能力：分子间作用力氢键分子筛作用：多孔性质特点原理 62应用：苷类、皂苷、生物碱、萜类、黄酮等大分子化合物的分离。洗脱规律和洗脱过程与普通吸附色谱相似：对极性吸附剂来说，成分极性越大，越难洗脱；洗脱剂的极性越大，越易洗脱。 一、高效液相色谱法在经典柱色谱法基础上发展起来的一种具有高效、快速、高灵敏特点的色谱分离方法。63其他色谱法高效液相色谱的原理与一般液相色谱十分相似，样品的分离取决于其在流动相和固定相中的分配。特点是使用高压输液泵进行洗脱，并配备有紫外等检测系统，使分离达到高速化和高效化。 二、气相色谱法流动相：气体固定相：液体或固体基本原理：利用化学成分在气体与固定相之间吸附能力不同或分配系数不同的差异而分离的色谱分离方法。适用范围：沸点低、易挥发的挥发油类成分。64 思考题1、薄层色谱中，吸附剂、被分离物质及溶剂三者之间的关系如何？2、聚酰胺分离下列黄酮类化合物时（以MeOH为溶剂），最先洗脱下来的是（）65 3、根据不同性质的化学成分，用连线选择与其相适应的色谱分离方法：氧化铝吸附柱色谱法分子量大小不同的化合物凝胶滤过柱色谱法碱性亲脂性化合物聚酰胺吸附柱色谱法黄酮类化合物离子交换色谱法酸性亲脂性化合物硅胶吸附柱色谱法离子性化合物66 谢谢！67 高血压、低血钾的诊断和鉴别诊断 高血压、低血钾的诊断与鉴别诊断明确高血压和低钾血症的诊断对高血压和钾缺乏程度及其临床危险性进行判断，有无合并因素加重高血压和低血钾危险病因诊断一种疾病：同一种疾病两方面的表现两种疾病或情况：两种独立的疾病或情况的临床表现 高血压、低血钾的病因鉴别诊断病因鉴别诊断常较复杂，有赖于详细的病史采集、体检和必要的实验室检查。要详细了解药物应用史、饮食情况、大小便情况、有无引起高血压和或低血钾的相关疾病还应注意完成下列步骤：1.是否存在转移性低钾血症；2.是否存在摄入不足和肾外丢失过多；3.是否存在肾脏失钾（尿钾测定）；4.血浆肾素、ALD（血K+3mmol/L以上）、酸碱平衡状态、阴离子间隙测定 高血压的鉴别诊断（一）原发性高血压继发性高血压肾原性高血压肾脏疾病：1.急性和慢性肾炎；2.慢性肾盂肾炎；3.放射性肾炎；4.先天性多囊肾；5.肾结核；6.巨大肾积水；7.肾肿瘤；8.肾结石；9.肾淀粉样变性肾动脉疾病：先天性或后天性，也可分为血管内或血管外病变。血管内病变包括：动脉内膜纤维组织增生、动脉粥样硬化、肾动脉炎、肾动脉血栓形成或栓塞、肾动脉瘤、先天性肾动脉畸形（缺如、狭窄、囊性动脉瘤）、肾动静脉瘘、以及肾动脉外伤。肾动脉周围粘连、肾蒂扭转，也可引起肾动脉狭窄。 高血压的鉴别诊断（二）全身性疾病累及肾脏：1.结节性多动脉炎：发热、WBC增多或兼有嗜酸性粒细胞增多、中度贫血、进行性消瘦、肾功能损害。高血压是由肾小球肾炎、或栓塞性肾炎、或多发性肾梗塞所致；2.SLE：9-12%，多在疾病后期，常伴有氮质血症；3.硬皮病：在有肾损害时，可有高血压；4.多发性大动脉炎：常引起大动脉任何部位或其分支的狭窄及闭塞，如侵犯肾动脉，可发生肾血管性高血压，腹部或肾区可闻及血管杂音，但通常本病以无脉征为主要临床表现；4.糖尿病：毛细血管间肾小球硬化、肾小动脉硬化；5.痛风；6.过敏性紫癜；7.急性肾衰；8.慢性铅中毒 高血压的鉴别诊断（三）内分泌疾病肢端肥大症、巨人症：（40%、2%）、PRL增加、AVP增加、垂体卒中甲亢、甲减、甲旁亢（MEN-2a）Cushingsyn嗜铬细胞瘤、肾上腺髓质增生症原发性醛固酮增多症先天性肾上腺皮质增生：先天性酶缺乏所致的肾上腺皮质增生，临床上共有六型，其中11羟化酶缺乏症（皮质醇与醛固酮合成障碍，致ACTH分泌增多，血浆11-去氧皮质酮与雄激素水平增高，导致多毛症、高血压、低血 高血压的鉴别诊断（四）钾等症状，并有幼年女性病人假两性畸形、幼年男性病人假性性早熟的表现，PRA和ALD的水平低下）、17羟化酶缺乏症（此酶参与皮质醇和性激素的合成，缺乏时血浆皮质醇及雌激素与雄激素均减少，通过负反馈促进ACTH分泌增多，刺激肾上腺皮质增生，合成大量11-去氧皮质酮与皮质酮而致水钠潴留、血容量增多、高血压、低血钾、低钾碱血症等表现，性激素缺乏则导致性器官发育障碍、第二性征缺如）肾小球旁细胞瘤：罕见，分泌大量肾素。临床表现有严重高血压、高血浆肾素、高ALD血症与低血钾，女性较多 高血压的鉴别诊断（五）糖尿病绝经期高血压：神经不稳定，阵发性潮热、出汗，心动过速、月经失调，血压增高。绝经前后1-3年出现，波动大，因紧张、体力劳动而波动，停经后多数恢复正常其他MEN男性更年期SynLiddlesyn异源性ACTHsyn早老症Flabrysyn：-半乳糖苷酶活性缺乏、脑胺三己糖苷Achard-Thierssyn：HBP、肥胖、多毛、轻度男性化、肾上腺增生、或DM 高血压的鉴别诊断（六）心血管疾病主动脉粥样硬化：中年以上，SBP升高，DBP正常或稍下降，主动脉弓突出，A2亢进主动脉瓣关闭不全：SBP升高，DBP降低，脉压差增大，周围血管征阳性动脉导管未闭：SBP升高，DBP降低，脉压差增大主动脉缩窄：75%在降主动脉，狭窄近心段血压升高，而远心段血压降低。围产期心肌病：产前1个月和产后5个月，以心肌损害为主的充血性心衰，心脏扩大，奔马律与水肿，80%有HBP 高血压的鉴别诊断（七）高山病：65%HBP，53.3%心衰完全性AVB：HR缓慢，代偿性心输出量增加，使SBP增加，同时舒张时间延长，故DBP下降，脉压增大脚气病性心脏病：长期vitB1缺乏，心输出量增加，SBP增加，周围小动脉扩张，DBP降低及脉压增大畸形性骨炎：受累骨骼产生很多细小的动静脉瘘，引起周围循环阻力降低，导致心输出量增加，从而发生HBP（主要是SBP升高） 高血压的鉴别诊断（八）神经系统疾病颅内压增高综合征间脑综合征其他原因妊娠中毒症血卟啉病真性红细胞增多症：血容量增多和血液粘稠度增加而引起高血压（50%），一般以SBP升高为主药物副作用：长期用GC；少数避孕药物、雄激素增多、EPO、三环类抗抑郁药、环孢霉素、拟肾上腺素类药物、非甾体类解热镇痛药、单胺氧化酶抑制剂 低血钾的鉴别诊断（一）胃肠道膳食摄入不足胃肠道的丢失（呕吐、胃肠液引流、肠胆胰瘘、创口引流、严重腹泻、输尿管乙状结肠吻合术等）肾脏排钾利尿剂（袢利尿剂、噻嗪类、碳酸酐酶抑制剂等）渗透性利尿剂 低血钾的鉴别诊断（二）盐皮质激素（样）作用过度原发性ALD增多症继发性ALD增多症：恶性高血压、肾性高血压、肾素瘤、Barttersyn食用甘草糖皮质激素过多（Cushingsyn、异位ACTHsyn、外源性GC使用）先天性肾上腺增生症：可分泌非ALD的盐皮质激素肾上腺酶缺陷：11-羟类固醇脱氢酶缺陷，皮质醇向脱氢皮质酮的转化障碍，前者与ALD受体结合而发挥ALD的作用（假性）肾小管疾病肾小管酸中毒LiddlesynFanconisyn 低血钾的鉴别诊断（三）远端肾小管液中不被重吸收的阴离子增多：使管腔侧负电位下降，K+分泌增加。如：代碱、远端型肾小管酸中毒、DKA时酮体升高、应用大剂量的青霉素远端肾小管液流量增加或Na浓度升高：前者由于肾小管液K+浓度降低，K+重吸收减少；后者Na+重吸收增多，使肾小管管腔负电位升高，促进K+分泌。如用利尿剂、渗透利尿剂、失盐性肾病、急性肾衰的多尿期、肾梗阻解除的早期低钾血症由于钾离子向细胞内转移（体钾不少）低钾性周期性麻痹胰岛素的作用低镁血症 高血压、低血钾的常见原因（一）原发性醛固酮增多症原发性高血压病人因其他原因如服用排钾利尿剂、慢性腹泻等致低钾血症肾缺血而引起高血压，如急进性原发性高血压、肾动脉狭窄性高血压，患这些疾病的患者可因继发性ALD增多症而合并低钾血症，但此类患者的BP一般较原发性HBP患者更高，进展更快，可伴有明显的视网膜损害。此外，此类HBP患者往往有急进性肾衰的临床表现，伴氮质血症、酸中毒。部分肾动脉狭窄患者可听到肾区血管杂音，肾图、静脉肾盂造影、单侧肾功能检查可显示一侧肾功能减退。这类病人血浆肾素活性增高，有利于鉴别诊断 高血压、低血钾的常见原因（二）失盐性肾病（失钾性肾病）：通常由于慢性肾盂肾炎所致，往往有高血压、低血钾。患者肾功能损害较明显，尿钠排出量较高，常伴有脱水。血钠不高反而降低，无碱血症，往往呈酸血症，低钠试验显示肾不保钠等肾素瘤：分泌大量肾素致高血压、低血钾。病人较年轻，而高血压严重，血浆肾素活性高，血管造影可显示肿瘤Cushingsyn：尤以腺癌和异位ACTHsyn所致者可伴明显低血钾，临床症群可资鉴别'