最新基因工程菌的发酵课件PPT.ppt 48页

'基因工程菌的发酵 第一节工程菌的来源和应用一、何谓基因工程基因工程（geneticengineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。 基因工程的核心技术是DNA的重组技术。重组即利用供体生物的遗传物质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA分子，然后在将重组DNA分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。除DNA重组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。 四、工程菌的应用1，基因药物红细胞生成素胰岛素干优素乙肝疫苗生长激素粒细胞巨噬细胞集落刺激因子 2，其它发酵产品酶制剂氨基酸（苏氨酸、色氨酸）抗生素 第二节工程菌的培养就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目标产物，工程菌和常规微生物并无太多的差异。但工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，以及安全性等问题，使得工程菌的培养有着自身所特有的特点。 一、安全问题关于基因工程的社会问题，必须提到它的潜在危险性。经过重组的菌和质粒一旦用于工业化生产，就不可避免地进入自然界。这些菌能间接地危害人体健康，使治疗药物失去效用，污染环境等。因此，安全问题是极其重要的。 1974年，提出了DNA重组实验具有潜在生物危险性的问题。后来，制定了有关DNA重组实验的准则，其目的是保证实验的安全和推动重组DNA的研究。这些准则参照了防止病原微生物污染的措施，以及根据对实验安全度的评定，采用物理密封(P1~P4)和生物学密封(B1和B2)两种方法。 物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。实验规模在20L以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。密封程度分为P1、P2、P3和P4级，数字越大，密封水平越高。生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。按密封程度分B1和B2级，B2级的密封要求最严格。 二、工程菌培养的特点工程菌工业化培养中，产物的产率往往比实验室培养规模为低。为提高工程菌体表达效率，需采取适当措施，提高重组DNA在受体细胞内的拷贝数及促进表达产物自细胞内向细胞外分泌。工程菌体的原宿主通常是某些培养物质(如某种氨基酸或维生素等)的缺陷型，有些基因工程细胞生产过程亦产生某些抑制细胞生长的代谢物。在培养过程中应考虑控制培养液营养成分及其浓度，同时采取措施，消除抑制细胞生长的代谢物，以保证细胞正常生长。 三、工程菌的培养工程菌的营养控制质粒稳定性重组质粒拷贝数的控制及表达效率 1，底物浓度的控制在基因工程茵培养过程，至少要遵循PI级物理防护的规定，因此必需进行菌体的高密度培养。从生物安全性考虑，培养的基因工程菌通常是维生素或氨基酸的营养缺陷型突变株。 2，质粒稳定性（1）质粒不稳定的类型分离性不稳定：这是由于在细胞分裂过程中质粒缺失分配到子细胞中而导致整个质粒丢失。结构性不稳定：这是由于重组质粒DNA发生缺失、插入或重排引起的质粒结构变化。 （2）影响质粒稳定的因素与质粒稳定有关的基因及质粒结构自身对其稳定性的影响宿主对质粒稳定的影响质粒拷贝数重组质粒的表达对质粒稳定性的影响 （3）使质粒稳定的措施组建合适载体选择适当宿主施加选择压力抗生素添加法抗生素依赖变异法营养缺陷型法控制基因过量表达控制培养条件 （4）质粒保持率为考察质粒稳定性，在此引入质粒保持率Fn的概念，Fn表示分批培养中细胞分裂n次后，培养液中基因工程细胞数与总细胞数的比值，即 假定在分批培养过程中，细胞在对数生长期每次分裂时，其质粒丢失率为P，则Fn为 3，表达效率及质粒拷贝数控制在工程菌培养过程中，表达效率与质粒拷贝数有关。在质粒稳定基础上，应尽可能提高细胞内质粒拷贝数。在工业生产中易于操作的方法是在培养的不同阶段，采用不同培养温度达到提高拷贝数目的，在前培养阶段采用低温，以减少细胞负荷，此时拷贝数较低，而比生长速率升高，在主培养中途升高温度，质粒拷贝数增加，目的基因产量提高。 第三节工程菌分批培养动力学对于质粒脱落性不稳定，细胞在分裂时丢失质粒的概率为p，则 所以对于底物对于产物 第四节培养装置与产物的提取工程菌的培养与普通微生物的培养方法类似。在进行以工业化为目的的DNA重组实验，以及为生产异种基因产物而培养重组菌时，当然应采用简便易行的培养系统。现在多半使用大肠杆菌为宿主，而在一般的通气搅拌罐中大肠杆菌能生长良好。 一、培养罐作为基因重组体的培养装置，与一直沿用的通气搅拌培养罐要有区别，即不仅要防止外部微生物侵入罐内，还必须采用不使培养物外漏的培养装置。按实验准则，可把这类密闭型通气搅拌式培养罐划分为操作液量20L以上和20L以下两种。现今使用的微生物培养装置，按其灭菌法又可分两类。一是在高压灭菌器中进行培养基及培养罐的灭菌，罐本身通常是玻璃制的，容量在10L以下的居多；另一类是20L以上的培养罐，一般为不锈钢制品，多采用通新鲜蒸气进行灭菌。 二、工程菌外漏的防范首先应了解培养微生物在普通通气搅拌罐中可能发生外漏的部位和操作。归纳起来有：排气，机械密封，接种，取样，培养后的灭菌(通入湿热蒸气)，排液(输至下一工序)。 1，排气 2，机械密封考虑培养液外漏的情况，培养基因工程菌时，以用上部搅拌的双机械密封为好。 3，取样普通培养罐的取样管道在取样时会流出样品。取样后对样品管道灭菌时，未灭菌的培养液污水被排至排水管内。对此，必须采取措施，如用取样工具进行取样。此法可在培养液不接触外界的条件下取样。 4，培养后的灭菌培养后对培养液和管道等进行灭菌时，一开始流出的末灭菌排水有可能存在活的重组菌。取样、排液的管道中能产生这类排水，因此，一定要另行安装排水管并与废液灭菌贮槽等相连接，以便排放污水。 5，接种向罐内直接接种的方法是不安全的。简单的安全接种法是将种子瓶与培养罐以管相连接后，用无菌空气加压压入的方法。另一种方法是先把种子液在安全柜内移至供接种用的小罐内，再将其与培养罐连接，用蒸汽对连接部分灭菌后，把种子罐中的种子液接入培养罐内。 6，排液培养后要将培养液输送至贮罐等下一道工序，这时也有可能产生气溶胶和重组菌的扩散。安全的方法是在培养开始前就将排液口与下段工序相连接并进行灭菌，这样培养一结束即可直接输送培养液。如果排液口未与下段工序相连那就应与连结废液灭菌罐的排水管道相接，这样就安全了。 三、培养罐的管道布局下图表示重组菌培养罐(P2、P3级)的整体流程图。重组菌培养罐中，凡有可能外漏重组菌的部分都与排污管道相连。图中所示的管路能分离并排出污染重组菌的污水。 四、基因工程产品的提取和精制传统的发酵产品和基因工程产品在提取和精制上的不同，主要表现在下列两方面：传统发酵产品多为小分子(工业用酶除外，但它们对纯度要求不高，提取方法较简单)，其理化性能，如平衡关系等数据都已知，因此放大比较有根据；相反，基因工程产品都是大分子，必要数据缺乏，放大多凭经验。基因工程产品大多处于细胞内，提取前需将细胞破碎，增添了很多困难。 另外，对于基因工程产品，还应注意生物安全(biosafety)问题，即要防止菌体扩散，特别对前面几步操作，一般要求在密封的环境下操作。例如用密封操作的离心机进行菌体分离时，整个机器处在密闭状态，在排气口装有一无菌过滤器，同时有一根空气回路以帮助平衡在排放固体时系统的压力，无菌过滤器用来排放过量的气体和空气，但不会使微生物排放到系统外。 大隐静脉高位结扎剥脱术李梦思 大隐静脉大隐静脉起于足背静脉弓内侧端，经内踝前方，沿小腿内侧缘伴隐神经上行，经股骨内侧髁后方约2cm处，进入大腿内侧部，与股内侧皮神经伴行，逐渐向前上，在耻骨结节外下方穿隐静脉裂孔，汇入股静脉，其汇入点称为隐股点。有五条属支：旋髂浅静脉、腹壁浅静脉、阴部外静脉、股内侧浅静脉和股外侧浅静脉。大隐静脉曲张行高位结扎时，须分别结扎、切断各属支，以防复发。大隐静脉全长的官腔内，有9~10对静脉瓣。通常两静脉相对，呈袋装，可保证血液向心回流。此外大隐静脉与小静脉借穿静脉与深静脉交通。穿静脉的瓣膜朝向深静脉，可将浅静脉的血因流入深静脉。当深静脉回流受阻时，穿静脉瓣膜关闭不全，深静脉血反流入浅静脉，可导致下肢浅静脉曲张。 并发症1、血栓性浅静脉炎2、湿疹和溃疡3、曲张静脉破裂出血 静脉曲张形成原因由于先天性血管壁膜比较薄弱或长时间维持相同姿势很少改变，血液蓄积下肢，破坏静脉瓣膜二产生静脉压力过高，是血管突出皮肤表面的症状。 静脉曲张手术方式1、单纯大隐静脉高位结扎、剥脱加交通支静脉结扎术。适合无深静脉瓣膜关闭功能不全单纯大隐静脉曲张者。2、单纯大隐静脉高位结扎、剥脱、交通支静脉结扎术，加深静脉瓣膜功能修复术。适合深静脉瓣膜关闭功能不全并浅静脉曲张者。 现病史患者，楚恒德，男，44岁，因右下肢浅静脉迂曲扩张2年余入院。患者源于2年余前右下肢浅静脉迂曲扩张，当时症状较轻，迂曲仅限于小腿下部，无不适未给予治疗，近年来右下肢浅静脉血管迂曲不断加重，并伴有患肢下垂时肿胀不适，久站则有患肢疼痛，经休息或抬高可有好转。门诊拟“右大隐静脉曲张”收住。 既往史手术外伤史：2前行肛瘘手术，否认重大外     伤及其他手术病史。药物过敏史：无药物及食物过敏史。重要药物应用史：否认速效救心丸、洋地黄等重要药物应用史。婚育史：已婚已育家族史：否认家族遗传病史 相关检查1、病毒四项：阴性2、B超超声提示：双下肢动脉粥样硬化右侧大隐静脉返流右侧大隐静脉增宽右下肢浅静脉曲张伴右侧小腿中下段内侧浅           静脉腔内血栓形成 护理诊断1、焦虑：与担心术后恢复有关2、生活自理能力低下：与术后活动度降低有关3、有皮肤完整性受损的危险：与术后皮肤愈合情况有关4、知识缺乏：缺乏疾病相关知识 手术配合1、消毒皮肤（碘伏纱布），铺巾2、腹股沟切口，递刀片在腹股沟处作一直切口#3、游离大隐静脉，递血管钳，甲状腺拉钩，找出静脉分离出约1cm长后，用血管钳挑起。4、结扎静脉远端 挑起静脉后，递组织剪，挂7#线，结扎静脉远端，近端血管切口用血管钳夹住。 5、内踝部切口 递刀片在内踝前一方与静脉走行方向平行或垂直的切口，游离静脉，同法用4#线结扎远端。6、插管 递剥离子，将剥离子管端垂直对准静脉切口，轻轻插入静脉官腔内，使管端抵达腹股沟静脉切口处，挂4#线分别结扎近端。 7、游离切除大隐静脉分支，递蚊式钳、组织剪，挂1#线结扎或7×17角针1#线缝扎。#8、抽剥大隐静脉，递7×17角针1#线缝扎各切口。9、包扎伤口 备碘伏水消毒皮肤，递纱布块覆盖伤口，用弹力绷带加压包扎。手术完毕。'