最新第四章酶学分析技术课件PPT.ppt 84页

'进入夏天，少不了一个热字当头，电扇空调陆续登场，每逢此时，总会想起那一把蒲扇。蒲扇，是记忆中的农村，夏季经常用的一件物品。　　记忆中的故乡，每逢进入夏天，集市上最常见的便是蒲扇、凉席，不论男女老少，个个手持一把，忽闪忽闪个不停，嘴里叨叨着“怎么这么热”，于是三五成群，聚在大树下，或站着，或随即坐在石头上，手持那把扇子，边唠嗑边乘凉。孩子们却在周围跑跑跳跳，热得满头大汗，不时听到“强子，别跑了，快来我给你扇扇”。孩子们才不听这一套，跑个没完，直到累气喘吁吁，这才一跑一踮地围过了，这时母亲总是，好似生气的样子，边扇边训，“你看热的，跑什么？”此时这把蒲扇，是那么凉快，那么的温馨幸福，有母亲的味道！　　蒲扇是中国传统工艺品，在我国已有三千年多年的历史。取材于棕榈树，制作简单，方便携带，且蒲扇的表面光滑，因而，古人常会在上面作画。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇诸名，实即今日的蒲扇，江浙称之为芭蕉扇。六七十年代，人们最常用的就是这种，似圆非圆，轻巧又便宜的蒲扇。　　蒲扇流传至今，我的记忆中，它跨越了半个世纪，也走过了我们的半个人生的轨迹，携带着特有的念想，一年年，一天天，流向长长的时间隧道，袅第四章酶学分析技术 酶（enzyme）的本质：高度特异性、高度不稳定性，高效性、可调节性酶的应用：由活细胞产生的能高效催化特异生化反应的蛋白质，属于生物催化剂酶的特点：酶活性的检测、代谢物的酶学分析和同工酶及亚型测定用于临床诊断和疗效判断2 主要内容：酶活性测定的基本知识酶活性单位的计算与校准酶活性的测定代谢物的酶法检测同工酶测定3 一、酶活性定义：酶活性（enzymeactivity）也称为酶活力，指酶促反应速率，即规定条件下在单位时间内产物的生成量或底物的减少量。表示方法：或式中v：反应速率，[P]：产物浓度，t：时间，[S]：底物浓度。7 二、酶活性单位与酶活性浓度（一）酶活性单位定义：表示酶的相对含量，指在一定条件下，单位时间内生成一定量的产物或消耗一定量的底物所催化的酶量。表示方法：惯用单位（一定的反应量/一定的反应时间）国际单位IU（µmol/min）Katal单位（mol/s）8 1．惯用单位：20世纪60年代以前根据酶活性测定方法建立者的姓氏命名的单位ALP的金氏单位（King）氨基移转酶的卡门氏单位（Karmen）特点：各单位对温度、时间、物质量的定义不同，导致各测定值、参考范围相差很大，彼此间无法比较,现在临床应用较少。卡门氏单位：1.0ml血清在25℃，340nm，反应体积3.0ml,光径1.0cm时每分钟测定吸光度下降0.001，即消耗4.8210-4μmolNADH为一个卡门氏单位举例：金氏单位：100ml血清ALP在37℃与底物作用15min，产生1mg酚。9 2.国际单位IU（µmol/min）定义：在规定条件下（25℃及其他最适条件），每min催化1µmol底物转变为产物的酶量，为1IU或1U，1IU=1µmol/min。IFCC,2001年37℃3．Katal单位定义：1Katal是在规定条件下，每秒钟催化1mol底物转变为产物的酶量。1Katal＝1mol/s。IU与Katal单位的关系：1katal=60×106IU，1IU=16.67nkatal10 （二）酶活性浓度酶活性浓度指单位体积样本中的酶活性单位。国际单位用IU/L或U/L表示。酶活性浓度才具有临床可比性，但其多数情况下都被不严格地称为酶活性单位乃至酶活性.11 三、酶促反应进程以产物生成量（或反应物减少量）为纵坐标、反应时间为横坐标作图所得到的一条曲线，称为反应进程曲线（或反应时间曲线、速率曲线、时间曲线）t1t2时间t图5-1酶促反应进程曲线吸光度A延滞期线性期非线性期12 （一）延滞期（lagphase、延迟期）特点：为反应的初始阶段，反应速率一开始时较慢，通常为几秒到几分钟t1t2时间t图5-1酶促反应进程曲线吸光度A线性期非线性期R1R2延滞期孵育期延滞期13 （二）线性期此阶段酶促反应速率基本保持恒定；对底物而言，为反应速率与底物浓度[S]的零次方成正比的零级反应，即不受底物浓度的影响，而只与酶活性浓度成正比；此时底物的消耗量小于5%，反应速率为反应初速率。酶活性浓度越高，线性期就越短线性度：判断线性期的一个指标，指吸光度（A）相对于时间（min）变化的可以接受的程度。线性度=［前半段△A/min－后半段△A/min］/［（前半段△A/min＋后半段△A/min）/2］×100％线性度值越小则线性越好。一般判断标准：不大于15％，否则判为非线性特点：可代表酶促反应速度14 （三）非线性期（偏离线性期、平坦期）进入非线性期的原因：反应的不断进行，底物消耗越来越多，酶变性失活增加、可逆反应增强、产物抑制增加等使得反应速率明显下降。特点：若为单底物的反应，则此时反应速率与单底物浓度[S]的一次方成正比，为一级反应。15 四、酶促反应动力学研究内容：研究酶促反应的速率及其各种影响因素（如底物浓度、酶活性浓度、温度、pH、激活剂和抑制剂等）的科学指导选择底物种类、确定底物浓度，确定最适温度、最适pH、激活剂和抑制剂类型与含量等，从而准确测定酶活性或代谢物浓度。研究意义:16 （一）酶促反应酶促反应式米氏方程：K417 （二）Km的含义与意义1．Km的含义:当Km=[S]时，，可见Km值等于反应速率达到最大反应速率Vmax一半时的底物浓度。2．Km的意义Km是酶的一个特征性常数（其他如等电点），Km的大小只与酶的性质有关反映酶对底物亲和力的大小选择酶的最适底物或天然底物计算不同底物浓度时的反应程度鉴别酶的种类判断可逆反应的速率判断酶偶联反应的限速反应计算工具酶的用量18 （三）Vmax的含义定义：Vmax表示在一定酶量时的最大反应速率，即酶完全被底物所饱和时的反应速率，与酶活性浓度呈正比。应用：计算酶的转换数（TN，催化常数Kcat）单位时间内每个酶分子将底物分子转换成产物的最大值。计算公式为：(单位是s-1)计算时要保证酶的浓度单位与底物的浓度单位一致）19 （四）Km和Vmax的测定1、双倒数作图法：纵轴截距为斜率为横轴截距为Linweaver-Burk作图法20 利用此图还可用于判断可逆性抑制反应的性质：如竞争性抑制：为表观KmKmKm21 第二节酶活性单位的计算与校准一、酶活性单位的计算（掌握）二、酶活性单位的校准（了解）内容简介：22 一、酶活性单位的计算（一）通用公式前提条件：必须保证启始底物量充足（[S]》Km），使酶促反应处于零级反应期即线性期，反应初速率等于最大反应速率，从而使酶发挥最大活性——mu与酶活性正相关，而与启始底物量无关23 注释：式中U：酶活性单位数，m0：规定的产物生成量或底物消耗量，V0：规定的样本体积，t0：规定的反应时间，mu：实际产物生成量或底物消耗量，Vu：实际样本体积，tu：实际反应时间实测的酶活性大小规定的酶活性单位(5.1)24 （二）采用酶活性惯用单位的计算公式常用设立标准管（校准管）的对比法（简称对比法、比较法）测量吸光度的变化求出。特点：校准管并不含酶常用定时法（固定时间法）求ΔA,ΔA=A终止点-A空白也可用不设校准管的比尔定律摩尔吸光系数法求出mu的确定方法：25 惯用单位的计算公式：测定产物生成类的计算公式测定底物消耗类的计算公式根据测定对象26 1、测定产物生成类的计算公式mu为生成的产物量，反应后从无到有，其存在量即生成量，与酶活性成正比常规计算方法和公式：设立一个校准管，与测定管同步操作。特点：·Cc=Cu△Au：测定管吸光度，△Ac：校准管吸光度，Cc：校准物摩尔浓度，Vc：校准物体积Mu=Cu×Vc（5.2）27 校准曲线法和公式：设立多个校准管制备△A-U校准曲线，测出△A值后查出U值其中，k1和△Ac都是变量，随不同的Vc而呈比例变化。上相当于直线方程Y=bX。图5-3纵坐标上某一点△Au(=△Ac)相对应的横坐标U值为k1。各校准管所相当的酶活性单位数k1可由其不同的Vc代入公式算出。（）(5.3)28 测定管：血清0.1ml加底物液等后于37℃水浴15min，再加显色液显色。同时，设立除先不加血清、其它步骤相同的空白管（在反应最后加血清），510nm处以空白管调零测出△Au。校准管：以校准曲线中第2管为例。取0.05mg/ml的酚校准液0.4ml，加显色液等至总体积与测定管相等，用蒸馏水替代酚校准液、其它步骤相同的空白管调零，510nm处测出△Ac。【计算】由式5.2有：可见，第2管相当于酶活性单位为：20金氏单位/100ml血清，常简写为20金氏单位。【单位定义】1金氏单位：100ml血清ALP在37℃与底物作用15min，产生1mg酚。【操作】例:金氏法测定血清ALP。29 2．测定底物消耗类的计算公式mu为消耗的底物量，反应后从多到少在测定底物消耗类时，将不加样本不加底物而加蒸馏水、其他操作与测定管相同的操作管称为空白管；将不加样本而加蒸馏水、其他操作与测定管相同的操作管称为“对比”校准管（校准管）。空白管不含有底物。“对比”校准管与测定管反应前底物量相同。特点：单一校准管即“对比”校准管时的测定：因产物生成量与底物消耗量相等，将式5.2中代表产物生成量的△Au换成代表底物消耗量的△Ac-△Au后有：计算方法和公式：（5.4）30 例：碘色法测定血清淀粉酶（AMS）【单位定义】1惯用单位：100ml血清AMS在37℃15min，水解5mg淀粉。【操作】测定管：稀释10倍后的血清0.2ml中加0.4g/L的淀粉溶液1ml37℃水浴7.5min后显色。校准管(“对比”校准管)：用蒸馏水替代血清，其它步骤相同。反应完成后，660nm处以蒸馏水调零，分别测出△Au、△Ac。【计算】由式5.4有：31 （三）采用酶活性国际单位的计算公式1．用微摩尔吸光系数（µε）表示的国际单位计算公式摩尔吸光系数ε是表示吸光度与摩尔浓度（mol/L）、光径（cm）之间关系的一个法定计量单位.摩尔吸光系数微摩尔吸光系数毫摩尔吸光系数32 在连续监测法测定酶活性时，tu为酶促反应曲线线性期内时间变化值（亦可表示为△tu），△Au为线性期内测定管吸光度变化值上式中ε：摩尔吸光系数，Cu：样本摩尔浓度（原始浓度），l：比色杯光径。注意Cu/nu为比色杯中的样本摩尔浓度（比色浓度）。根据酶活性国际单位的定义：m0=1µmol，t0=1min。常取规定样本体积V0=1L。相应地，tu计量单位为min，ε变为µε的L·µmol-1·cm-1，l为cm，则用微摩尔吸光系数（µε）表示的国际单位计算公式由上式可简化为：(5.5)33 另外一种推导方式将比尔定律△Au=εCul/nu两边同时除以tu，结合样本稀释倍数展开后得到34 0.2ml样本中加入底物液于37℃15min，终止反应后总体积为5.2ml。405nm处以空白管调零，1cm比色杯中测△Au。已知对硝基酚在该条件下的ε为18380L·mol-1·cm-1。例:对硝基酚比色法测β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶（NAG）。【计算】由式5.7有35 2．用毫摩尔吸光系数（mε）、摩尔吸光系数（ε）表示的国际单位计算公式在吸光系数的数值关系上，以340nm处NADH（还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸，还原型辅酶Ⅰ）在一定条件下的吸光系数为例：ε=6.22×103L·mol-1·cm-1mε=6.22L·mmol-1·cm-1µε=6.22×10-3L·µmol-1·cm-1可见，mε值=103µε值，ε值=106µε值，各代入式5.5后有：（5.6）（5.7）（5.8）36 3．计算因数与测定产物生成类、底物消耗类的吸光度变化方向的关系式5.5、式5.6、式5.7中△Au/tu以外的部分都相等，称为计算因数Factor值（简称F值，或K值）：（5.9）由式5.9展开后可见，F值的单位是µmol/L。不作校准时可采用试剂盒厂家给定的F值.37 4．国际单位间无可比性国际单位数相同的不同酶并不表示酶含量相同，因为其具体反应条件不尽相同，酶的激活与抑制状态也不相同，故国际单位之间无可比性。一般用分光光度法测定酶活性，也可用荧光法测酶活性。荧光法测定酶活性的计算式与分光光度法计算式相似，仅将式中的吸光度A换成荧光强度F即可。（四）katal单位与国际单位间的关系式据定义，1katal=1mol/s=106µmol/(1/60min)=60×106µmol/min=60×106IU1nkatal=0.06IU1IU=16.67nkatal（五）荧光法测定酶活性单位的计算公式38 二、酶活性单位的校准(了解)两种方式：一是用实际测定的摩尔吸光系数ε进行校准；二是用酶校准物（calibrator，校准品）来校准。速率法测酶活性时，需要用实际测定的ε来计算真实的K值：将已知浓度的生色物如NADPH（还原型尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，还原型辅酶Ⅱ）、对硝基苯酚等，或底物如葡萄糖等作为样本进行酶活性测定，测出吸光度变化值后计算出真实的K值，再代入连续监测法公式可以比较准确地计算出样本酶活性含量。用实际测定的摩尔吸光系数ε进行校准:39 第三节酶活性的测定测定方法分类：按照仪器检测方法分类：分光光度法、浊度法、荧光法、放射性核素法、电位滴定法、电极法、量气法。按照反应时间分类；分为定时法、连续监测法和平衡法。按照检测对象分类：分为直接法和间接法。40 一、按照反应时间分类的酶活性测定方法（一）定时法原理：定时法是固定时间法的简称，是指测定反应开始后一段时间（t1～t2）产物的增加量或底物的减少量以测定酶活性的方法。该方法一般需要在反应进行到一定时间后用强酸、强碱、蛋白沉淀剂等终止反应。特点：优点：简单，因为最后测定时酶促反应已被终止，故比色时不需要保温设备，显色剂的选择也可不考虑对酶活性的影响。缺点：如果不做预试验则无法了解其酶促反应进程（t1-t2）是否为零级反应，故难以确保测定结果的准确性。吸光度At1t2时间t图5-6定时法的三种反应进程231定时法与两点法、终点法的区别41 （二）连续监测法原理：连续监测法是指在多个时间点连续测定产物（或底物）在线性期内的生成量（或消耗量）即零级反应速率以测定酶活性的方法，又称速率法、零级反应速率法、斜率法。该方法是在一定的反应时间区段内（至少9～120s）每隔一定时间（常为2～30s）读取一次吸光度值，连续测定多点（至少4点），然后对吸光度数据作最小二乘法处理，再用线性期内的数据计算单位时间内的反应速率△A/min，最后据式5.7等计算出酶活性。（5.7）42 43 特点：与定时法相比，属于即时观测，无需停止酶促反应、不需添加其他呈色试剂，且可将多点的测定结果绘图连线，快速、直观查看酶促反应进程，很容易找到呈直线的线性期，检查到是否偏离零级反应；连续监测法要求不显色而是直接测定底物（或辅助底物即中间底物）或产物量的变化，因此，在测定原理上，可以选择紫外吸收法或生色原显色法；要求能够准确地控制温度、pH值和底物浓度等，要求仪器具有恒温装置及自动监测功能，半自动及全自动生化分析仪都能满足这些要求；测定结果常较定时法高，因为在酶促反应初始阶段底物最充裕，而产物的抑制作用、可逆反应、酶变性等均很小，所以反应后期的吸光度等检测信号就比定时法要高且真实，因而测定结果也较定时法准确。44 常用指示酶及其指示反应1．脱氢酶用作工具酶的脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱氢酶，例如LDH、MDH、G6PD、GLDH等，它们催化下列反应：P+NAD(P)H+H+PH2+NAD(P)+可对NAD(P)H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定应用：ALT、AST、CK等酶活性测定。 2．过氧化物酶POD可催化过氧化氢与某些色原反应，例如与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应，将其氧化为有色物质，反应如下：2H2O2+4-AAP+酚醌类化合物（红色）+4H2OTrinder反应：应用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与POD偶联，通过Trinder反应加以测定。POD （一）直接法指直接测定酶促反应产物或底物的理化指标以测定酶活性的方法。测定NAD（P）H的方法测定人工合成的色素原底物的方法测定耗氧量的方法测定pH改变的方法等二、按照检测对象分类的酶活性测定方法47 1．测定NAD（P）H的方法原理：监测340nm吸光度的变化可以反映NAD（P）H量的变化，其变化与待测酶的含量正相关。对象：以NAD（P）+或NAD（P）H为辅酶的脱氢酶类。例如LD、G-6-PD、GLDH等。48 人工合成的色素原底物待测酶产物的毫摩尔吸光系数对硝基苯酚磷酸二钠盐（PNPP-Na2）ALP对硝基酚（PNP）（405nm，pH10.3）18.5L-γ-谷氨酰-3-羧基对硝基苯胺GGT2-硝基-5-氨基苯甲酸（405nm，pH8.1）9.492-氯-硝基酚-α-半乳糖-麦芽糖苷AMS2-氯酚（2-CP）（405nm，pH6.0）6.12-氯-硝基酚-α-岩藻糖苷α-岩藻糖苷酶（AFU）2-CP（405nm，pH6.5）6.22．测定人工合成的色素原底物的方法原理：一些水解酶类或转移酶类通过酶促反应后，其化合物中的某一基团被水解或转移，使无色的底物转变为有色的产物，这类底物称为色素原底物。根据这一原理，可以人为地合成一系列底物即人工合成的色素原底物后测定酶活性。底物和测定对象：49 （二）间接法酶偶联法化学法是指加入相应试剂后间接测定酶促反应的产物转化物或底物转化物的理化指标以测定酶活性的方法。50 1．酶偶联法原理：在测定待测酶Ex的活性时，常采用偶联一个工具酶（指示酶Ei）或几个工具酶（辅助酶Ea和指示酶Ei）将待测酶的某一产物转化为新的产物，反应速率达到平衡时，测定指示酶的反应速率来代表待测酶的活性。反应模式可简化为：Ex、Ea、Ei这一连串酶促反应称为酶偶联体系零级反应一级反应一级反应[A]》Kmx[B]《Kma指示酶的反应系统：以NAD（P）+或NAD（P）H为辅酶的脱氢酶类作为指示酶，监测其反应物NAD（P）H于340nm处紫外吸收或在紫外激发光365nm波长照射下，其在460nm发射强烈荧光的变化速率的测定系统；是偶联过氧化氢（H2O2）以过氧化物酶（POD）为指示酶的测定系统。Trinder反应：51 表5-4一些酶偶联法的待测酶与工具酶待测酶辅助酶指示酶指示系统ALT无LDNAD(P)HASTLD*LD、苹果酸脱氢酶（MD）NAD(P)HCKHKG6PDNAD(P)H5‘-核苷酸酶（5‘-NT）腺苷脱氨酶（ADA）GLDHNAD(P)HLPS共脂酶、甘油激酶（GK）、GPOPODH2O2*LD：消除内源性丙酮酸的干扰。52 2．化学法化学法是在反应体系中加入一些与酶促反应无关同时也不影响酶活性的试剂，这些试剂只和酶反应物（一般是产物）迅速作用，产生信号变化。丁酰硫代胆碱ChE硫代胆碱（SCh）硫代胆碱（SCh）+5，5‘-二硫代-双（2-硝基苯甲酸）5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-TNBA）（黄色）53 第四节酶活性测定最适条件的选择一、标本1.溶血2.抗凝剂3.标本存放时间二、测定条件底物浓度、酶浓度、温度、酸碱度、辅助因子、激活剂和抑制剂 【概述】【概念】１．痉病：以颈项强急、口噤不开、甚至角弓反张为主症的一类疾病。２．湿病：阳气不足、感受外湿或兼风挟寒,侵犯肌表、流注关节所致的以发热、身重、骨节疼烦为主症。 3.暍病:即伤暑，以发热自汗、烦渴溲赤、少气脉虚为主症，初起多见表证。每易兼挟湿形成虚实挟杂之候。暍【合篇意义】病因—感受外邪证候—初起太阳表证 【原文解析】湿病一微汗法【原文】风湿相搏，一身尽疼痛，法当汗出而解，值天阴雨不止，医云此可发汗，汗之病不愈者，何也？盖发其汗，汗大出者，但风气去，湿气在，是故不愈也。若治风湿者，发其汗，但微微似欲出汗者，风湿俱去也。（18） 【解析】[病因]风湿相搏——合邪、风湿互结于表[症状]一身尽疼痛——卫外之阳气痹阻[治法]法当汗出而解——汗法[问题]汗之病不愈者，何也？ [原因]1．值天阴雨不止——久雨湿胜，湿邪不易宣泄但风气去2.汗大出者病不愈也（1）病邪性质：①风性轻扬易表散②湿性粘滞难骤除（2）汗不得法：①湿气存留②更伤其阳（大汗易伤阳）轻则伤卫阳，重则亡阳伤阴湿气在 [汗法原则]若治风湿者，发其汗但微似欲汗出者，风湿俱去也微汗：阳气缓缓内蒸，营卫畅行，使滞留肌腠、关节间的风湿之邪均除。 【按语】1．微汗是一切汗法的原则。2．“微汗”是指服用发汗剂后汗出程度，非指药力而言。 二、利小便【原文】太阳病，关节疼痛而烦，脉沉而细者，此名湿痹。湿痹之候，小便不利，大便反快，但当利其小便。（14） 【解析】太阳病湿邪在表太阳经证：发热恶寒、身疼而重脉沉而细—湿邪凝滞，阳气被阻小便不利—湿阻于内，阳气不化大便反快—脾虚湿生，湿胜则濡泄治法：但当利其小便——利小便以除湿邪关节疼痛—湿流关节，痹阻不通而烦—因疼痛而烦扰不宁湿痹之候外湿内湿 1头中寒湿【原文】湿家病身疼发热，面黄而喘，头痛鼻塞而烦，其脉大，自能饮食，腹中和无病．病在头中寒湿，故鼻塞，纳药鼻中则愈。（19）【证治】 身疼发热，面黄——阳被湿郁而喘——表郁肺气失宣头痛鼻塞而烦——寒湿在上，清阳被郁脉象——其脉大——大主表鉴别——自能饮食，腹中和无病——病不在中焦病机：头中寒湿——局部治法：纳药鼻中——通肺窍，除寒湿。主症【解析】 【原文】湿家身烦疼，可与麻黄加术汤发其汗为宜，慎不可以火攻之。（20）2寒湿在表 【解析】湿家——湿痹日久，脾素被湿困身烦疼－寒湿痹阻，经脉不通治法：发其汗为宜——方后注，复取微似汗方药：麻黄加术汤麻黄汤——发汗以除寒湿白术——1固表，制约麻黄汤发汗太过2健脾走表，运表里之湿 【原文】病者一身尽疼，发热，日晡所剧者，名风湿。此病伤于汗出当风，或久伤取冷所致也。可与麻黄杏仁薏苡甘草汤。（21）3风湿在表 一身尽痛——特点：身掣痛而屈伸不利。阳被湿遏发热风为阳邪，湿易化燥化热日晡所剧者——日晡为申时，为阳明之气所主故病剧（疼与热均加重）湿郁阳气[病因]（1）此病伤于汗出当风湿从外侵（2）或久伤取冷所致[病机]风湿相搏，阻遏肌表。风湿症状【解析】 麻黄——解表宣阳化湿炙草——和中、倍于麻黄缓急薏苡仁——利湿清热杏仁——宣利气机治法：轻清宣化、解表除湿、缓急止痛方药：微汗麻杏苡甘汤 【按语】麻杏苡甘汤证与麻黄加术汤证比较方剂证名病因病机主证治法麻杏苡甘汤风湿在表风湿郁于肌表，阻遏阳气，化燥化热倾向一身尽疼，呈游走性，屈伸不利，发热日晡所剧轻清宣化解表祛湿麻黄加术汤寒湿在表寒湿着于肌肉，阳气不通身疼烦而重着、无汗、恶寒辛温散寒除湿 【原文】风湿，脉浮、身重，汗出恶风者，防己黄芪汤主之。（22）4风湿兼表虚 【解析】脉浮——主表为风身重——湿胜之征汗出恶风病机：风湿在表，表虚证治法：益气固表、祛风除湿主症风湿伤于肌表素体表虚、腠理疏松、卫气不固 方药：防己黄芪汤黄芪白术防己甘草姜、枣益气固表除湿调和营卫、健运中焦、助卫 加减法：喘——风湿伤肺肺气不利加麻黄宣肺平喘胃中不和——湿邪困脾——加芍药缓急利水湿气上冲——水湿聚于下焦循冲脉上冲加桂枝通阳化气平冲下有陈寒——加细辛散陈寒痼冷 5风湿表阳虚【原文】伤寒八九日，风湿相搏，身体疼烦，不能自转侧，不呕不渴，脉浮虚而涩者，桂枝附子汤主之；若大便坚，小便自利者，去桂加白术汤主之。（23） 【解析】一段：伤寒八九日——表邪过期不解身体疼烦风湿相搏不能自转侧不呕——湿邪未传里犯胃不渴——湿邪未郁而化热浮虚——表阳已虚涩——湿滞症状鉴别脉 病机：风湿表阳虚治法：温经助阳、散寒祛风除湿方药：桂枝——辛温祛在表之风邪附子——温经助阳、散寒除湿甘草姜、枣调和营卫、辛散除寒桂枝附子汤 二段:服用桂枝附子汤后风邪已除“风气易去”，但寒湿仍在（以湿邪为主）大便坚寒湿在表，不在里服桂枝附子汤伤津小便自利——湿不在里去桂——风邪已去加白术合附子祛表之寒湿生白术润肠通便白术附子汤鉴别 6表里阳虚【原文】风湿相搏，骨节疼烦，掣痛不得屈伸，近之则痛剧，汗出短气，小便不利，恶风不欲去衣，或身微肿者，甘草附子汤主之。（24） 骨节疼烦掣痛，不得屈伸，近之则痛剧——风湿相搏，由浅入深汗出恶风不欲去衣——表阳虚甚短气小便不利里阳亦虚，不能化湿或身微肿【解析】 病机：风寒湿俱盛，表里阳气俱虚治法：温经助阳，祛风除湿方药：缓急甘草健脾缓药势白术——健脾除湿附子——温经助阳，散寒除湿桂枝——通阳散寒甘草附子汤 方剂性质病因病机脉证治法麻黄加术汤表实证寒湿在表身烦痛、重着、恶寒、无汗解表散寒除湿麻杏苡甘汤风湿在表阳气被郁一身尽痛、发热、朝轻暮重轻清宣化解表除湿防己黄芪汤表虚证风湿在表卫外不固脉浮身重、汗出恶风、或腰以下肿益气固表祛风除湿桂枝附子汤风湿在表表阳虚身体痛烦、不能自转侧、脉浮虚而涩温经助阳祛风除湿白术附子汤寒湿在表表阳虚上证加大便坚、小便自利温经助阳除湿散寒甘草附子汤表里阳虚风寒湿俱盛表里阳虚骨节疼烦掣痛、不能屈伸、近之痛剧、汗出短气、小便不利、恶风不欲去衣或身微肿温经扶阳散寒祛风除湿 【治禁】1．禁攻下（16）2．禁大汗、宜微汗（18）3．禁火攻（20）'