最新菌种的传代与保藏12课件PPT.ppt 59页

'菌种的传代与保藏12 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种.微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种保藏是一项重要的基础工作，是微生物学基础工作的一项重要内容，也是药品微生物工作中的一项常用技术。一、菌种保藏的意义 如药品中的控制菌检查使用的阳性对照菌须防止因多次传代而使阳性对照菌的典型生物学特征发生变化及菌株的死亡，保证达到菌种长期正确的形态；如药品微生物学检验过程中，检出的可疑致病菌须妥善保藏，以达到进一步鉴定的目的，保证用药安全。 1.琼脂斜面低温保存法（1）方法：将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种用牛皮纸保好，为减缓培养基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶塞。放在4℃左右的冰箱中保藏。每隔2~3个月移种一次，继续进行保藏。若用半固体高层培养基穿刺培养，一般可保藏半年~一年。有的甚至更长时间。（2）适用范围：细菌、酵母菌、霉菌保藏。 大肠杆菌斜面金黄色葡萄球菌斜面 生孢梭菌白色念珠菌需气菌、厌气菌培养基真菌培养基 各类菌种保藏条件及时间菌种培养基保存温度传种时间细菌一般多用于营养琼脂或根据菌种规定选用培养基4~6℃芽孢杆菌3~6个月，其它细菌每个月酵母菌一般用麦芽汁琼脂或麦芽汁酵母膏琼脂4~6℃一般4~6个月丝状真菌一般用PDA琼脂、蔡氏琼脂或麦芽汁琼脂等4~6℃每4个月移植一次（每2个月移植一次） （3）特点：优点是——简便，易于推广；一般不需要另选择保藏用培养基；对大多数微生物都适用。缺点是——保藏期太短；传代次数多，易发生变异及污染。 （4）注意事项：保藏的菌种应是生命活力旺盛的新鲜培养物，至少应是第三代的培养物。保藏时，破伤风杆菌可用庖肉培养基；生孢梭菌用流体硫乙醇酸盐培养基。必须定期检查保藏菌种冰箱的温度、湿度以及菌种管的棉塞是否松动或生霉，如有异常应及时处理。每次移植后，应与原菌种的编号、名称逐一核对，确证培养基特征和纯度无误后再继续保藏。保藏菌种的培养基应无糖，其他菌类含糖小于2%为宜，以免产酸过多，影响菌种存活。铜绿假单胞菌在冰箱中易发生菌体自溶而死亡，不宜用本法保存。 2、液体石蜡保存法：本法是用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。（1）方法：将菌种接种于斜面或穿刺于0.3~0.5%琼脂半固体高层培养基中，培养好备用。取化学纯的液体石蜡装在试管中，每管10~15ml，加棉塞，瓶口包上纸，121℃高压灭菌30min，取出置37℃温箱或110~170℃烤箱中1~2h或干燥器内除去液体石蜡中的水分。 将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内，液体石蜡液面以高出培养基最上端1㎝为宜，将试管直立，放入4℃冰箱中保藏。适用范围：适用于保藏部分霉菌，酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果较差。 液体石蜡对各类菌种保藏效果菌种菌株数保存时间（年）存活率（%）细菌霉菌酵母菌放线菌87586400380552420.983.688.991.3 各类菌种保藏条件及时间菌种保存方法温度传种时间大肠杆菌营养琼脂斜面营养肉汤菌悬液4～6℃0℃以下2～3个月1年乙型副伤寒沙门菌营养琼脂斜面营养肉汤菌悬液4～6℃0℃以下2～3个月2年金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面营养肉汤菌悬液4～6℃0℃以下2～3个月4年滕黄微球菌营养琼脂斜面营养肉汤菌悬液4～6℃0℃以下2～3个月4年铜绿假单胞菌营养琼脂斜面液体石蜡覆盖保存法室温室温2～3个月2年枯草芽孢杆菌营养琼脂斜面半固体营养肉汤菌悬液4～6℃4～6℃0℃以下6～12个月1～2年4年以上短小芽孢杆菌营养琼脂斜面半固体营养肉汤菌悬液4～6℃4～6℃0℃以下6～12个月1～2年4年以上生孢梭菌庖肉培养基液体石蜡覆盖保存法4～6℃4～6℃6个月2年白色念珠菌改良马丁斜面4～6℃6个月 （3）特点：本方法简便易行，是实验室常用的一种保藏方法，该法主要使菌种与空气隔绝。（4）注意事项：①保藏时，用新鲜培养物接种，应检查纯度和特征后，方可进行保藏。②保藏过程中，需经常观察斜面是否干燥，如干燥，需重新移种。③使用菌种时，先将菌种管倾斜使液体石蜡流至一边，再用接种针挑取培养物接种到新鲜斜面上培养，待长出新培养物后，再移种一次到新斜面上即可使用。 ④将沾有少量液体石蜡的接种针浸于95%酒精中片刻，再烧灼灭菌，以免直接在酒精灯下烧灼时，液体石蜡四溅，引起污染。⑤液体石蜡在菌种管中高出培养基的高度要严格控制，如太多，会影响菌种交换气体，使保藏效果不好；如太少，斜面容易干燥，将缩短保藏期。一般以高出斜面1㎝为宜。⑥制备无菌液体石蜡时，每管装量不能太多，否则分装到菌种培养基中易造成污染。 3、半固体琼脂培养基（0.5%）4、40%甘油保存法： 四、试验用菌种的培养传代方法程序：冻干菌复苏————接种（斜面）（菌种传代）（营养肉汤）制备菌悬液对照菌液检定用标准菌种，由中国药品生物检定所提供，为冷冻干燥菌种。菌种的复苏与保存在专用无菌室或超净工作台内进行。 1菌种的复苏•把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化工作台。•先用砂轮将冻干菌种安瓶颈部挫出刻痕,再将冻干菌种管外壁用碘酒擦洗消毒、稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上，烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，使骤冷而炸裂。 •取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，另取1支灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面置35~37℃培养22~24h。•取出培养物，仔细观察菌苔形态、有无杂菌、涂片、革兰氏染色镜检，呈典型菌落后，转种3代即可应用。如发现菌型不典型，可进行平板分离单菌落。 2菌种的传代与保存方法（1）：菌斜面菌斜面（保存）•培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上著名菌名及接种日期。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。•点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠进火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手用无名指、小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环伸人管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种棒，并将菌种管口移至火焰旁。 •堵上棉塞，左手将菌种管放下，取营养琼脂斜面1支，照上述操作打开棉塞，将接种环伸入管内至琼脂斜面的低部，由底向上，将接种环轻贴斜面的表面曲折移动，使细菌划在斜面的表面上。•取出接种棒，在火焰旁将培养基管棉塞堵上，然后将接种过细菌的接种棒在火焰上烧灼灭菌。•将已接种毕的细菌管置35~37℃培养22~24小时，霉菌管一般置20~25℃霉菌培养箱内培养7日。取出后放人冰箱保存，一般3个月转种一次。 方法2：菌斜面营养肉汤分离平板菌斜面如果菌落形态不典型可纯化，按下列方法传代（分离菌落）：用接种环取上述菌管（斜面）菌苔少许接种置营养肉汤中(5ml/支,已灭菌),置35~37℃培养18~24小时后，再用接种环取培养好的营养肉汤菌悬液（浓菌液），接种于分离平板，置35~37℃培养18~24小时，用接种针选典型菌落划线于营养琼脂斜面，置35~37℃培养18~24小时。一般同时接种几支管，其中一支用于以后菌种传代或接种到半固体琼脂培养基中，其它用做工作菌种。 常用分离平板：大肠埃希菌——EMB琼脂平板 铜绿假单胞菌——溴化十六烷三甲铵琼脂培养基 金黄色葡萄球菌——甘露醇氯化钠琼脂培养基 沙门菌——SS琼脂平板 3菌悬液的制备取上述培养好的菌种斜面移入接种室或净化工作台，放置室温后,用接种环取菌苔少许接种置营养肉汤中(5ml/支,已灭菌),将已接种毕的细菌管置35~37℃培养18~24小时，取出备用。一般于冰箱中保存可用7天。 4对照用菌液制备取上述培养好的营养肉汤菌悬液（浓菌液）1ml，加到9ml0.9%无菌氯化钠溶液混匀，为10-1，再取另一只吸管吸取10-1菌液1ml加到9ml0.9%无菌氯化钠溶液混匀，为10-2……以此类推，稀释至含活菌数在50~100个。用平板计数。此稀释菌液用于试验后加阳性对照，可在1天内使用。 菌种菌种工作菌种培养基菌悬液对照菌液大肠杆菌营养琼脂斜面营养肉汤0.9%氯化钠溶液沙门菌营养琼脂斜面营养肉汤0.9%氯化钠溶液金黄色葡萄球菌营养琼脂斜面营养肉汤0.9%氯化钠溶液铜绿假单胞菌营养琼脂斜面营养肉汤0.9%氯化钠溶液生孢梭菌硫乙醇酸盐培养基硫乙醇酸盐培养基0.9%氯化钠溶液白色念珠菌真菌琼脂斜面真菌培养基0.9%氯化钠溶液 五、菌种保管•菌种保管应有专人负责，保存与加锁的冰箱中或特制的白铁箱中加锁置阴暗处，确保菌种安全。因工作变动时，必须做好交接工作。•菌种应有详细登记本，包括名称、分离日期、鉴定日期、鉴定者、主要鉴定性能，并注意记录使用、转移及销毁情况和原因。•各种菌种应按规定时间定期移种。一般每移种3次后作一次全面鉴定。注意菌种有无污染和变异，如发现污染和变异时，应及时更换。•购置菌种，应有介绍信。全部保存菌种应具备清单，并定期向部门负责人报告。 由于验证试验中包括黑曲霉菌，因此要尽可能避免细菌和霉菌在同一洁净工作台或同一间无菌室进行操作。应将这一问题反映到有关所级领导，求的领导的理解和支持。有条件的地方所正在进行或计划对无菌室进行改建和扩建，这些所在规划时应对微生物检查特性给予适当考虑。此外，从事微生物检查的工作人员也应该注意个人防护，避免由操作不当而导致的生物危险。除生物危险外，还应加强微生物检查的安全管理。 谢谢大家 第三章数学教学设计程向阳2005年10月20日 §3.1教案设计数学教学设计,是为数学教学活动制订规划的过程教案设计三要素:(1)教学目标_____课堂教学的灵魂(2)设计意图_____教学方法和教学策略(3)教学过程_____可操作的手段,教学情境,各个教学环节,评价方案 教案案例___“一元二次方程”(P93)内容与形式:(一)教学目标____知识/能力/德育目标(二)教学设计(重点/难点/关键)___情境/内容/方法(三)教具准备___课件/小黑板/模型(四)教学过程___问题情境/探索新知/巩固练习/小结作业/板书设计(五)教学后记 点评教案三要素由实际问题引入新课程,激发学习动机联系新旧知识,引导学生比较,概括新知层层递进,变式练习,搭桥铺路,建构概念数学教学是数学思维过程的教学如何设计思维过程和提炼数学思想方法教学有法,教无定法.和而不同,同则不继 §3.2数学教学目标的确定教学目标是数学教学过程起点,也是教学活动的结果教师要教什么数学?学生要学什么数学?学生学完这些数学能够做什么?教学目标有远期目标,近期目标,过程目标 例如:新课标中“数学推理”目标让学生经历探索基本的数量关系,图形性质,建立基本的数学模型和了解基本几何变换性质等数学活动过程,在活动中发展他们的合情推理能力让学生从对若干生活事例和数学现象的研究入手,进一步学习有条理的思考与表达.体会证明的必要性,理解证明基本过程要求学生从几个基本事实出发,证明一些有关三角形,四边形的基本性质,进而掌握综合法证明的基本格式,初步体会公理化思想. (续)远期目标实现周期很长,通常是一个课程,或一个学习领域.或一个核心观念的教学追求如:(1)“发展学生‘用数学’的意识和能力”;(2)“发展学生的空间观念”;(3)“培养学生的方程思想”非一日之功,避免空洞,得不到落实 例:培养推理能力的教学目标探索三角形全等的条件_____具体的教学活动:画一个三角形与已知三角形全等了解变量之间的关系.例如一种数学表示能力___“读图”和“作图象”___可以引发许多推理活动(P101图3-1)案例:“婆说婆有理,公说公有理” 近期目标是某一课程内容学习过程中,或者某一学习环节(课时目标,单元目标等)结束时所要达到的目标它与特点的教学内容密切相关,具有很强的针对性可操作性既是当前教学活动就应实现的目标,也是实现远期目标的一个环节 例:“等可能性”内容的教学目标让学生经历掷骰子跑硬币玩转盘等活动,在活动中体会等可能性的含义让学生在玩获胜可能性相等的游戏中,了解游戏公平的含义,进一步体会等可能性现象让学生观察生活中包含等可能性的现象,说明等可能性与事件发生的概率之间的联系 过程目标课程标准中将教学目标分为:____知识技能目标____方法能力目标____情感态度目标例如:“经历—过程”目标____经历将一些实际问题抽象为数与代数的过程……(P102) 寓言《三个馒头》有一个人肚子饿了，就吃馒头，吃了一个没饱，就吃第二个，吃了两个还是没饱，就吃第三个，次下去三个，饱了。吃饱以后他后悔了：早知如此，不如就吃第三个馒头，前面两个都浪费了。案例：代数式概念（P103） §3.3设计意图的形成整体设计分析重点、难点学生水平 一些优秀创意巨人的手（费赖登塔尔）球的体积（马明）糖水浓度（罗增儒）“玩”坐标（上海） §3.4教学过程的展示常规数学教学的基本结构：——复习、引入、讲授、巩固、小结和作业——提出问题、形成概念、论证命题、建立模型具体教学环节的教学过程设计：——数学问题的教学设计；数学概念的教学设计；数学命题的教学设计；数学应用的教学设计；巩固课的教学设计 一、数学问题的教学设计数学教学活动就是组织成提出问题和解决问题的过程让学生在问题解决的过程中“做数学”、学数学、增长知识、发展能力数学教学设计的中心任务就是设计一个或一组问题串好的数学问题的特点：探索性、现实性、趣味性、开放性、拓展性 具体设计问题时的注意点处在学生能力的“最近发展区”（挑战性）新颖性、趣味性、现实性、艺术性层递性（层层递进、由浅深、易难）强化数学思想和模型用于解决问题 如何创设数学问题情境以数学典故、史实创设情境，激发情趣以数学知识的产生、发展过程创设情境，引导学生进行探索以数学知识的现实背景创设问题情境，使学生体会数学的价值以数学悬念来创设情境，吸引学生的注意力以数学活动和数学实验创设情境，让学生体会“做数学”的无穷乐趣以计算机多媒体课件作为创设工具，发挥现代教育技术的创新教育功能 二、数学概念的教学设计概念是数学知识的细胞，也是思维的单元，是最基本的思维形式概念是判断、推理的基础，又是判断、推理的结晶。“科学是和概念并肩成长的”深刻理解数学概念能发展抽象思维能力所谓数学教学上讲“概念不清、寸步难行”数学概念的教学设计分为引入、形成、巩固和运用等几个阶段 数学概念教学的要求理解定义掌握内涵概念分类概念关系例：函数概念的教学设计（P110） 三、数学命题的教学设计数学命题教学的重要性：命题教学是发展学生数学思维过程一个很好的结合点数学中，用来表示数学判断的语句或符号的组合称为数学命题，包括公式、公理、定理以及数学题中的判断等。是进行正确推理的依据，也是论证方法的依据命题的设计包括：命题的提出、明确、证明与推导、运用与系统化 四、数学知识应用的教学设计例题（示范与模仿）习题（演练与解答）问题（数学讨论与解决）例子（P115） 五、数学巩固课的教学设计练习课：复习、典型例题分析、示范、练习、小结作业讲评课：情况介绍、分析评议、总结作业复习课：复习提纲、复习、总结、作业高密度、快节奏、大容量基本问题为核心，变式练习用开放题展开复习 思考与练习（作业）按照你的意图，对中学数学有关内容进行教学设计。要求：——设计一个教学片段；——可以用10~15分钟时间进行交流——在作业本上设计——下一周周五交'